基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，先通过酶切反应获取完整糖蛋白上的糖链作为模板分子，再利用硼亲和作用将模板分子固定于硼酸功能化基体材料表面，随后利用硅烷化试剂进行缩聚反应形成印迹层，最后在酸性条件下移除模板形成印迹空腔，从而得到基于分子印迹的凝集素模拟物。该凝集素模拟物制备简单，成本低廉，性质稳定，并且所识别的目标物更容易释放。具有良好的专一性、亲和力，且抗干扰能力强。不仅能识别完整糖蛋白，而且能识别糖蛋白的特征片段-糖肽和聚糖。在用于复杂生物样品时仍能保持其专一识别能力。该材料在糖蛋白组学、代谢组学、糖生物学、疾病诊断和兴奋剂检测等方面有着良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法与应用
本专利技术属于分子印迹功能化材料领域，具体说是一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备以及其在复杂样品中对糖蛋白及其特征片段的专一性识别与分离，以及其在蛋白质组学、代谢组学、糖生物学、疾病诊断和兴奋剂检测等方面的应用。
技术介绍
抗体是能专一识别特定分子(抗原)的一类蛋白质分子，在生物化学、生物医学和临床诊断等领域具有重要应用。抗体通常只能识别完整的抗原分子，而当抗原分子发生酶解或降解后，抗体通常无法识别抗原破碎后产生的片段。因此，对于生物体内或生物样品中不稳定的重要生物分子，如糖蛋白等，对其本身和其特征片段的专一识别具有重要意义。凝集素是可以特异性识别含有特定糖或糖基的生物分子(如糖蛋白、糖肽和聚糖等)的一类蛋白质。凝集素不仅可以识别完整糖蛋白而且能识别由糖蛋白酶解得到的糖肽及糖链片段或是其他含有糖基的部分。因此，凝集素可以通过识别不稳的糖基化分子的特征片段来监测其在生物体内的代谢过程。目前凝集素被广泛的应用于蛋白质组学、糖组学以及疾病诊断等领域中。然而，天然的凝集素具有一些明显缺陷，如难于制备，稳定性差以及难于释放已结合的目标物等。因此，发展出具有类似于凝集素识别特性的仿生材料具有重要的科学意义和实际应用价值。硼亲和作用是选择性识别顺式二羟基类化合物的一类独特方法，在仿生识别中具有重要作用[J.Yan,H.Fang,B.H.Wang,Med.Res.Rev.《医学研究评论》2005,25,490-520；A.Pal,M.Bérubé,D.G.Hall,Angew.Chem.Int.Ed.《德国应用化学》2010,49,1492-1495]。其原理是，在较高的pH条件下，硼酸配基能和顺式二羟基化合物中的邻二羟基共价结合，形成共价复合物；而在酸性条件下，共价复合物解离，从而释放出顺二羟基分子。单纯的硼亲和材料不能特异性地识别特定的顺式二羟基分子，但是，取代硼酸配基已经作为重要的亲和配基在仿生亲和材料的制备中发挥重要作用[Y.C.Liu,Y.Lu,Z.Liu,Chem.Sci.《化学科学》2012,3,1467-1471；Y.Lu,Z.J.Bie,Y.C.Liu,Z.Liu,Analyst《分析师》2013,138,290-298]。尤其是，将硼亲和作用与材料的纳米空腔的选择性相结合，多种专一识别糖蛋白的分子印迹聚合物已经广泛报道[L.Li,Y.Lu,Z.J.Bie,H.Y.Chen,Z.Liu,Angew.Chem.Int.Ed.《德国应用化学》2013,52,7451-7454；Z.Lin,L.X.Sun,W.Liu,Z.W.Xia,H.H.YangG.N.Chen,J.Mater.Chem.B《材料化学B》2014,2,637-643；Y.X.Li,M.Hong,M.Miao,Q.Bin,Z.Y.Lin,Z.W.CaiG.N.Chen,J.Mater.Chem.B《材料化学B》,2013,1,1044-1051]。然后，这些分子印迹聚合物只能识别完整的糖蛋白，无法识别糖蛋白分子上的特征片段。分子印迹技术[G.Wulff,A.Sarhan,Angew.Chem.Int.Ed.《德国应用化学》1972,11,341-345；G.Vlatakis,L.I.Andersson,R.Müller,K.Mosbach,Nature《自然》1993,361,645-647]是先将模板分子与功能单体按一定比例形成配合物，再加入交联剂形成聚合物从而将模板分子固定并包裹在聚合物中，然后采用合适的方法将模板分子去除，从而在聚合物中留下形状与模板分子互补的空腔及选择性的结合位点。尽管已有诸多文献报道了以单糖为模板的分子印迹材料[G.Wulff,R.Grobe-Einsler,W.Vesper,A.Sarhan,Makromol.Chem.《大分子化学》1977,178,2817-2825；Z.L.Cheng,E.K.Wang,X.R.Yang,Biosens.Bioelectron.《生物传感与生物电子》2001,16,179-185W.J.Wizeman,P.Kofinas,Biomaterials《生物材料》2001,22,1485-1491]，但是，具有凝集素分子识别特性，即既能专一识别完整糖蛋白又能专一识别糖蛋白的特征片段的分子印迹材料从未见报道。此外，以糖链为模板的分子印迹聚合物目前尚未见报道。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法及该凝集素模拟物的应用；它是利用分子印迹技术制备具有类似凝集素分子识别特性的功能化材料。本方法以糖链为模板，利用硼亲和分子印迹为技术基础，所得材料不仅可以识别完整糖蛋白，同时还可以识别糖蛋白特征片段(糖链和糖肽)。该材料具有良好的专一性和亲和力，且抗干扰能力强，用于复杂生物样品时，也表现出同时识别完整糖蛋白以及其特征片段的能力。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，该方法是先通过酶切反应获取完整糖蛋白上的糖链作为后续印迹步骤的模板分子，再利用硼亲和作用将模板分子固定于硼酸功能化的基体材料表面，再利用硅烷化试剂在合适条件下的缩聚反应形成印迹层，最后在酸性条件下移除模板形成印迹空腔，从而得到基于分子印迹的凝集素模拟物。所述糖链可以是任意糖蛋白上的不同结构的糖链，这些不同糖型的糖链体现在实施例1和4中。所述糖链包括核糖核酸酶B，或者转铁蛋白；或者其他糖蛋白。所述基体材料是指取代硼酸功能化基体材料，是硼酸功能化的磁性纳米颗粒、或者磁性微球、或者其他纳米材料和玻璃片或其他表面材料等。所述模板分子通过与硼酸配基间的硼亲和作用而被固定于硼酸功能化基体材料表面。所述取代硼酸是含有羟基、醛基、羧基、巯基、不饱和键或氨基等活性基团的苯硼酸或杂环硼酸。所述硅烷化试剂是由正硅酸乙酯或其他取代正硅酸酯，所述硅烷化试剂的浓度为1至50mM。所述印迹层的厚度通过控制反应条件(如反应时间、硅烷化试剂的浓度)进行控制精确控制(通常控制在糖链模板分子长度的三分之一至三分之二)。反应时间一般为40到90分钟。此项操作体现在实施例3和4中。所述酸性条件是酸性溶液，包括但不限于0.1M的醋酸溶液。利用上述步骤可以制备得到基于分子印迹技术的凝集素模拟物。上述凝集素模拟物具有类似凝集素的分子识别特性，不仅能识别特定完整糖蛋白，同时还能识别该糖蛋白的特征片段-聚糖和糖肽。但与天然凝集素相比，该分子印迹材料容易制备，价格低廉，性质稳定，而且所识别的目标物更容易释放。该技术制备的凝集素模拟物专一性好、抗干扰能力强。上述凝集素模拟物在糖蛋白及其特征片段的专一识别、富集、纯化、分离和检测方面的应用。有益效果：与现有技术相比，本专利技术首次提出了基于糖链的硼亲和定向表面印迹技术，成功制备了用于模拟凝集素的分子印迹材料。与天然凝集素相比，该材料制备简单，成本低廉，性质稳定，并且所识别的目标物更容易释放。该技术与所得凝集素模拟物目前尚未有类似文献和专利报道。该技术所制备的凝集素模拟物专一性识别能力好，抗干扰能力强，不仅能识别完整糖蛋白，而且能识别糖蛋白特征片段，用于复杂生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于，该方法为：先通过酶切反应获取完整糖蛋白上的糖链作为后续印迹步骤的模板分子，然后通过硼亲和作用将模板分子固定于硼酸功能化基体材料表面，再利用硅烷化试剂进行缩聚反应形成印迹层，通过缩聚反应的反应条件来控制印迹层对模板分子的覆盖程度，最后在酸性条件下移除模板分子形成印迹空腔，从而得到基于分子印迹技术的凝集素模拟物。

【技术特征摘要】
1.一种基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于，该方法为：先通过酶切反应获取完整糖蛋白上的糖链作为后续印迹步骤的模板分子，然后通过硼亲和作用将模板分子固定于硼酸功能化基体材料表面，再利用硅烷化试剂进行缩聚反应形成印迹层，通过缩聚反应的反应条件来控制印迹层对模板分子的覆盖程度，最后在酸性条件下移除模板分子形成印迹空腔，从而得到基于分子印迹技术的凝集素模拟物。2.根据权利要求1所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于：所述的糖链是任意目标糖蛋白上的不同结构的糖链。3.根据权利要求1所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于：所述基体材料是取代硼酸功能化的材料；所述取代硼酸功能化的材料是硼酸功能化的磁性纳米颗粒、或者磁性微球。4.根据权利要求3所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，其特征在于：用于硼酸功能化的取代硼酸为含有羟基、或者醛基、或者羧基、或者巯基、或者氨基活性基团的苯硼酸或杂环取代硼酸。5.根据权利要求3所述的基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘震，别子俊，陈阳，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32