一种快速鉴定虾蟹卵母细胞核的透明液制造技术

本发明专利技术涉及水产养殖领域，提供了一种能够用于快速透明虾蟹卵母细胞的透明液及用这种透明液处理和检查虾蟹卵母细胞成熟情况的方法。透明液为无水乙醇、冰醋酸和甲醛按60∶1∶30体积比的混合物。上述透明液可应用于处理虾蟹类卵母细胞，能有效的透明虾蟹的卵母细胞，上述透明液可用于快速鉴定虾蟹类卵母细胞生发泡。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水产养殖领域，具体为一种处理虾蟹卵细胞的方法，以及用于快速观察虾蟹卵细胞生发泡的透明液。
技术介绍
虾蟹类甲壳动物是重要的水产养殖品种，卵母细胞的发生主要包括三个时期:增殖期、生长期和成熟期。准确判断卵母细胞所处的发育期，对于在生产上及时掌握进行人工诱导卵母细胞成熟的时间具有重要实用价值，可以缩短虾蟹人工辅助育苗的周期，同时也是研宄虾蟹类卵细胞最后成熟机制必不可少的步骤。与其它多黄卵物种相似，虾蟹卵母细胞在生长期合成和储备大量的卵黄，以供受精后的胚胎发育之用。其卵母细胞在生长期完成卵黄积累后，进入最后减数分裂成熟阶段，此阶段卵母细胞生发泡(卵核，细胞核)的位置首先从中央向卵母细胞周围移动，然后核膜瓦解消失，形成减数分裂相包括纺锤体、染色体的形成等，最终停留在减数分裂中期I，之后才能排卵、受精，因此，可根据卵母细胞生发泡的有无或位置判断卵母细胞所处的发育时期。由于大量卵黄物质的积累，使得虾蟹卵母细胞的光通透性较弱，因此，用肉眼和解剖镜都很难直接观察到生发泡，目前通常只有对虾蟹卵巢组织进行传统石蜡切片，通过苏木精-伊红染色(HE染色)后观察卵细胞的生发泡，从而确定卵细胞的发育时期。但是石蜡切片方法需要对卵巢样品进行固定、漂洗、脱水、浸蜡、包埋、切片、染色等一系列繁琐的试验步骤，对于一个操作熟练的实验人员来说，整个实验流程也要花费一周左右的时间。另夕卜，由于卵母细胞卵黄较多及卵母细胞膜的存在，在制作切片的过程中还经常会出现由于浸蜡不彻底而导致制片失败。加之，由于卵母细胞在经历生长期后体积增大，核质比小，在切片时因为切面未经过细胞核而容易造成卵母细胞生发泡破裂的假象，导致判断错误，从而对生产和科研造成一定的影响。前人在对斑马鱼卵子发生进行研宄时，用透明液(甲醇:冰醋酸=3:1)对积累卵黄的卵母细胞进行处理，能够清晰的观察到生发泡位置(李书鸿毛，韩文，孙志远，闫维，陈惠萍，严绍颐..斑马鱼卵母细胞的体外成熟及成熟卵的受精发育.生物工程学报.1993 ；04:314-9+96) ?在对其它经济鱼类的卵母细胞发育成熟研宄中，又分别用到了另外两种透明液:快速透明液和松节醇透明液。其中快速透明液的配方为:95%乙醇85份，40%的甲醛10份，冰醋酸5份。它能够2-3分钟内将卵母细胞透明，以观察其生发泡，但是，处理时间超时将会使生发泡也透明。而松节醇透明液在快速透明卵母细胞的同时也可以长时间的保持生发泡不被透明，其配方为:松节醇25份，50%酒精50份，冰醋酸25份(白遗胜等编著.淡水养殖500问.北京:金盾出版社.2006.06)。通过观察透明液处理的卵母细胞生发泡的位置或有无，确定卵母细胞发育时期的方法快速、简便，且较HE染色的结果更为准确。但是，由于卵母细胞内积累的卵黄含有多种蛋白质、脂类、糖类等不同的物质，且不同的物种卵黄的组成有很大的不同，所以能有效透明鱼类卵母细胞的透明液却不能透明虾蟹类生物的卵母细胞。因此需要探索一种适用于透明虾蟹类卵母细胞的透明液的配方。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种能够用于快速透明虾蟹卵母细胞的透明液及用这种透明液处理和检查虾蟹虾蟹卵母细胞生发泡的方法。本专利技术的技术方案为，一种用于处理虾蟹类卵母细胞的透明液，为无水乙醇、冰醋酸和甲醛混合物，其体积比为60:1:30。上述透明液可应用于处理虾蟹类卵母细胞，能有效的透明虾蟹的卵母细胞，并且在生发泡未破的卵母细胞内能清楚的观察到一不透明的小斑点。经石蜡切片HE检测，证实其为卵细胞的生发泡(即细胞核)。因此，上述透明液可用于快速鉴定虾蟹类卵母细胞生发泡(细胞核)。一种快速鉴定虾蟹类卵母细胞生发泡的方法，步骤为:将虾蟹类的卵巢组织置于所述透明液中，振荡使卵母细胞呈游离状态，静置I?60分钟，查看置于透明液中的游离的卵母细胞中生发泡的状态。优选的，振荡速度为50?800rpm，振荡时间为2?20min ;更优选的，，振荡速度为100?500rpm，振荡时间为5?15min。 优选的，静置时间为I?5分钟。优选的，所述的虾蟹类为中华绒螯蟹或罗氏沼虾。虾蟹类为中华绒螯蟹时，步骤(I)中，中华绒螯蟹卵母细胞会由紫色或黑色变为橘黄色。由于卵母细胞积累的大量卵黄，导致无法直接观察到虾蟹类卵母细胞的生发泡，而常规石蜡切片HE染色的方法所需时间长，操作繁琐，在生产和科研上有一定的局限性。本专利技术通过选择透明液的成分，并调整无水乙醇、冰乙酸和甲醛的比例，获得一种能有效的透明虾蟹类卵母细胞的透明液。该透明液处理成熟的虾蟹类卵巢，可获得透明化的卵母细胞，并且在卵母细胞内发现有一小的、不透明的小斑点，用石蜡切片HE检测，证实其为卵母细胞的生发泡。这说明该透明液能快速、有效的透明虾蟹的卵母细胞从而方便观察其生发泡。本专利技术的透明液使用方便，鉴定方法简单快速，鉴定结果准确，将为确定虾蟹卵细胞发育成熟情况、缩短虾蟹人工育苗时间及研宄其卵母细胞最后成熟的分子机制提供重要的帮助。【附图说明】图1为中华绒螯蟹及罗氏沼虾未经透明液处理、经透明液处理的卵母细胞，以及中华绒螯蟹及罗氏沼虾卵巢的石蜡切片结果。各图片中，卵母细胞的生发泡用箭头指出。其中A和D分别为中华绒螯蟹和罗氏沼虾未经透明液处理的卵母细胞；B和E分别为中华绒螯蟹及罗氏沼虾经透明液处理的卵母细胞；(:和F分别为中华绒螯蟹及罗氏沼虾卵巢的石蜡切片结果。【具体实施方式】材料试剂:中华绒螯蟹和罗氏沼虾购自上海浦东新区果园农贸市场，其中，中华绒螯蟹体重为90-100g，罗氏沼虾体重为15-20g。无水乙醇、冰乙酸、甲醛、二甲苯、甲醇等化学试剂，购自国药集团化学试剂有限公司(上海)。4%多聚甲醛固定液，苏木精、伊红染料购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。实施例1透明液处理中华绒螯蟹卵母细胞1.透明液处理方法:1、透明液的配制:取无水乙醇、冰乙酸和甲醛按照60:1:30的体积比配制透明液，现配现用。2、卵母细胞透明:将中华绒螯蟹解剖，取100毫克的卵巢组织置于15毫升的离心管中，加入3毫升左右的透明液，迅速剧烈震荡(100?500rpm)，使卵母细胞呈游当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于快速鉴定虾蟹卵母细胞生发泡的透明液，其特征在于，由体积比60：1：30的无水乙醇、冰醋酸和甲醛组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丘高峰，刘志强，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31