单链核酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种单链核酸适配体，所述适配体满足下述（1）和（2）：（1）具有5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-N-CCTTCCCCAAGACAGCATCCA-3’的通式，其中N代表长度为35-45bp的随机序列；（2）能特异性中和RhD抗体。所述N为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。本发明专利技术提供的单链核酸适配体，其能特异性的中和RhD抗体，其能制备成组合物、试剂盒或芯片可用于RhD抗体的检测，进一步的，其制备成治疗剂可用于新生儿溶血病的治疗，其制备成辅助剂可用于RhD阴性患者的急救输血。

【技术实现步骤摘要】
单链核酸适配体及其应用
本专利技术属于生物医学与临床医学
具体而言，本专利技术涉及单链核酸适配体及其应用。
技术介绍
核酸适配体(Aptamer)筛选技术是近年来新兴的一项多学科交叉研究技术，核酸适配体对靶分子的识别具有很强的特异性与高亲和力，在高灵敏检测分析、诊断、蛋白质相互作用、抗感染新药研发及难治性病毒感染性疾病(如AIDS、HBV、HSV、Rabiesvirus等)与癌症治疗等方面显示出广阔的应用前景。虽未见核酸适配体用于Rh血型系统方面的研究，但同类研究显示，多肽、细菌、病毒颗粒、哺乳动物细胞、核酸等可通过SELEX技术筛选出高亲和力的核酸适配体。核酸适配体可通过基因合成或PCR扩增的方法大量获得，成本低廉，而且寡核苷酸片段对人体无毒性。Aptamer与蛋白质的结合力高于抗原与抗体之间的结合，具有更高的灵敏度和准确性，可以弥补抗体在诊断领域中的不足，是理想的检测及治疗的材料。Rh血型系统(RhesusBloodGroupSytstem)是仅次于ABO血型的具有重要临床意义的血型系统，主要抗原有RhD、RhCc、RhEe。其中RhD抗原性最强，临床上根据个体是否存在RhD抗原而分为Rh阳性和Rh阴性。约75％的Rh阴性个体可通过输血、妊娠等途径产生RhD抗体，若再次输入RhD阳性血液可引起致命的溶血性输血反应、肾功能衰竭等。RhD阴性育龄妇女若与胎儿Rh血型不合还会引起新生儿溶血病(HemolyticDiseaseoftheNewborn,HDN)，导致新生儿出现黄疸、贫血、大脑损伤，甚至死亡。在临床输血治疗实践中，Rh血型系统相合性输注面临着两个难题：一是自身免疫性溶血性贫血患者的Rh血型系统不规则抗体鉴定，另一个是已产生RhD抗体个体的输血与治疗，如新生儿溶血病的治疗、RhD阴性个体的紧急输血等。临床上，红细胞血型抗体的检测主要是指不规则抗体的检测，目的是为了防止不规则抗体引起溶血性输血不良反应，以确保输血安全。抗体检测的基本原则是用已知抗原来检测未知抗体，并根据实验结果来判断样本中是否存在相应抗体。对于红细胞血型抗体检测而言，理想的方法是用已知的、高纯度的、单一血型抗原来进检测未知抗体。但由于科技水平的限制，目前尚无法得到各种单一的、纯化的红细胞血型抗原，所以检测红细胞血型抗体只能选择携有多种抗原的红细胞。通常将用于检测抗体特异性，携有多种血型抗原的多个个体的红细胞称为红细胞谱细胞，也称谱红细胞。采用谱红细胞检测抗体的原理是若被检样本中存在某种血型抗体，分别与来自多个个体的谱红细胞混合后，就会表现出一种特有的反应格局：与有相应抗原的红细胞发生凝集反应的阳性结果，及与无相应抗原的红细胞不发生凝集反应的阴性结果，根据反应格局来判定血型抗体的特异性。应用谱红细胞检测不规则抗体是目前唯一检测不规则抗体的方法，但这种方法存在以下几个缺点：①红细胞保存时间短，并且随着保存期内时间的延长，部分血型抗原会降解消失，导致抗体检出能力下降；②由于多数红细胞抗原在人群中呈偏态分布，对于部分抗原阴性的红细胞很难找到，因此对某些不规则抗体无法鉴定区分；③对于存在多种抗体或自身抗体的情况下，谱红细胞无法鉴定不规则抗体的特异性；④目前采用谱红细胞鉴定抗体的方法无法实现自动化和标准化，也无法实现对抗体进行定量检测。因此，通过人工方法制备单纯抗原是解决以上缺点的有效途径。本专利技术通过筛选获得的能与抗-D特异性结合的aptamer，能够实现抗体鉴定的精确化、自动化，并且不受自身抗体以及其他因素的影响，对于血型不规则抗体的鉴定提供了新的途径，是方法学的一个飞跃。新生儿溶血病主要是指母婴红细胞血型不合引起的新生儿同种免疫性溶血性疾病，以同种免疫性溶血(ABO，Rh血型不合)最为常见也最为重要。新生儿同种免疫性溶血是由于母体存在与胎儿血型不相容的血型抗体(IgG)而引起的。胎儿红细胞进入母体循环后，若母体缺乏胎儿红细胞所具有的抗原时，母体就可产生相应的血型抗体，此抗体通过胎盘进入胎儿循环，则可引起胎儿红细胞致敏、破坏而出现溶血，导致贫血、水肿、肝脾肿大、生后短时间内出现进行性重度黄疸，甚至发生核黄疸而影响智力发育，并导致运动障碍。Rh新生儿溶血病以IgG型抗-D引起的最多见，孕妇如有高效价的抗-D常会导致流产、死胎或者早产，即使能分娩，新生儿的病情往往很严重，需进行换血治疗。目前Rh新生儿溶血病尚无有效的治疗手段，没有药物可以降低孕妇体内抗-D水平，只能寄希望于胎儿能坚持到分娩，并在出生后得到及时治疗，但因Rh阴性(D抗原阴性)血液很稀有，新生儿往往不能得到及时的换血治疗。我国汉族人群RhD阴性个体比例仅为0.2％～0.5％，Rh阴性血液是稀有血液，对于Rh阴性的急救患者来说，如果不能及时得到Rh阴性血液，就会危及其生命。为缓解上述危机，输血规则中允许对Rh阴性的急救患者给予Rh阳性血液，但仅限于没有产生RhD抗体的RhD阴性患者；对于产生RhD抗体的RhD阴性患者来说，仍然只能等待Rh阴性血液。
技术实现思路
本专利技术提供了一种单链核酸适配体，其能特异性的中和RhD抗体，其能制备成组合物、试剂盒或芯片可用于RhD抗体的检测，进一步的，其制备成治疗剂可用于新生儿溶血病的治疗，其制备成辅助剂可用于RhD阴性患者的急救输血。本专利技术提供了一种单链核酸适配体，所述适配体满足下述(1)和(2)：(1)具有5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-N-CCTTCCCCAAGACAGCATCCA-3’的通式，其中N代表长度为35-45bp的随机序列；(2)能特异性中和RhD抗体。所述N为SEQIDNO：2、SEQIDNO：7或SEQIDNO：8。本专利技术还提供了用于检测RhD抗体的组合物、试剂盒或芯片，其含有上述的单链核酸适配体或其组合物。本专利技术还提供了用于检测RhD抗体的组合物、试剂盒或芯片，其含有SEQIDNO：19。本专利技术还提供了上述的单链核酸适配体或其组合物用于制备RhD抗体检测试剂的用途。本专利技术还提供了一种新生儿溶血病患者使用的治疗剂，所述治疗剂包含上述的单链核酸适配体或其组合物。本专利技术还提供了一种新生儿溶血病患者使用的治疗剂，所述治疗剂包含SEQIDNO：14和SEQIDNO：20。本专利技术还提供了一种RhD阴性患者输血用的辅助剂，所述辅助剂包含上述的单链核酸适配体或其组合物。本专利技术还提供了一种RhD阴性患者输血用的辅助剂，所述辅助剂包含SEQIDNO：14和SEQIDNO：20。本专利技术的单链核酸适配体是由78～81个碱基组成的小分子物质，可特异性地与抗-D结合，故可作为检测试剂用于抗-D的检测。由于单链核酸适配体性质稳定，故可实现抗-D检测的标准化及定量检测。而且单链核酸适配体可以有效中和IgG型抗-D，使其失去生物活性，阻断与RhD抗原的特异性结合，避免红细胞的破坏，可以用于孕妇以降低其体内抗-D水平，起到预防抗-D引起的新生儿溶血病的作用，也可用于患儿以起到及时治疗的作用；因本专利技术的单链核酸适配体具有中和RhD抗体的特性，其对产生RhD抗体的RhD阴性患者可以先行使用，使其抗-D水平快速下降，就可以使用Rh阳性血液以得到及时救治，并且可在整个治疗过程中多次使用，以避免输血反应的发生。附图说明图1为实施例1的ssDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单链核酸适配体，所述适配体满足下述（1）和（2）：（1）具有5’‑AGAGACGGACACAGGATGAGC‑N‑CCTTCCCCAAGACAGCATCCA‑3’的通式，其中N代表长度为35‑45bp的随机序列；（2）能特异性中和RhD抗体。

【技术特征摘要】
1.一种单链核酸适配体，所述适配体满足下述（1）或（2）：（1）所述适配体的序列如SEQIDNO：19所示；（2）所述适配体是由第一适配体和第二适配体组成的组合物，所述第一适配体的序列如SEQIDNO：14所示，所述第二适配体的序列如SEQIDNO：20所示。2.用于检测RhD抗体的组合物、试剂盒或芯片，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张印则，吴凡，庄乃保，徐华，周华友，苏宇清，梁延连，李大成，周丹，
申请(专利权)人：深圳市血液中心，
类型：发明
国别省市：广东;44