一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌及制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌及制备方法和应用，步骤如下：(1)通过重叠PCR将cA基因与hMT基因拼接，两基因之间引入linker，N端引入促表达标签，得到重组cA-hMT基因；(2)将重组cA-hMT基因和表达载体进行连接，得到的连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞；(3)将步骤(2)得到的工程菌诱导表达重组融合蛋白，收获菌体超声破碎后离心，上清液直接与食品级乳酸乳球菌孵育，融合蛋白无需纯化则锚定至乳酸乳球菌表面。本发明专利技术方法制备的这种表面锚定有人I型金属硫蛋白的食品级乳酸菌，能够富集重金属，制备方法具有高效、安全无毒性、成本低、不需蛋白纯化等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌及制备方法和应用
本专利技术属于基因工程领域的基因重组表达
，具体涉及一种表面锚定有人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌制备方法及应用。
技术介绍
金属硫蛋白(Metallothionein,MT)具有非常保守的一级结构和相似的空间结构，广泛分布于动物、植物和微生物中，是一类富含半胱氨酸、低分子量(6000～7000道尔顿)、具有较强结合金属离子能力的蛋白质(VasakM.Advancesinmetallothioneinstructureandfunctions.JTraceElemMedBiol,2005,l19:13–17.)。MT具有结合重金属、清除自由基、抗辐射、抗衰老以及调节微量元素平衡等重要生理功能(YangFetal.High-yieldexpressioninEscherichiacoliofsolublehumanMT2Awithnativefunctions.ProteinExprPurif,2007,53:186–194.)。目前，MT已成为医学、生物化学、分子生物学以及环境保护等科研领域的热门研究课题。同时由于MT高效的重金属解毒功能与安全性，已被广泛应用于医疗、化妆品、保健品及环保等生产领域。利用重金属诱导动物可获得可溶性MT，但产量低且提纯步骤复杂繁琐，导致生产成本极高，限制了MT的应用。由于MT分子量小，半胱氨酸含量高，在原核体系中表达易形成包涵体，尚未见用大肠杆菌大量生产可溶性MT的报道(ButtTRetal.UbiquitinfusionaugmentstheyieldofclonedgeneproductsinEscherichiacoli.ProcNatlAcadSciUSA,1989,86:2540-2544)。目前，均采用GST、Sumo等促溶标签重组表达MT蛋白(HuangYetal.Expressionandpurificationofglutathionetransferase-smallubiquitin-relatedmodifier-metallothioneinfusionproteinanditsneuronalandhepaticprotectionagainstD-Galactose-inducedoxidativedamageinmousemodel,JPET,2009,329:469–478.)。乳酸菌(Lacticacidbacteria)是一种人体内的益生菌，被广泛应用于奶制品生产，肉、蔬菜、面包的发酵等方面，因此被普遍认为是安全级微生物(GenerallyRecognizedAsSafe,GRAS；GillilandSE.Healthandnutritionalbenefitsfromlacticacidbacteria.FEMSMicrobiolRev.1990,7(1-2):175-188)。从20世纪80年代开始，人们就开始致力于对各种乳酸菌尤其是乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的生物学特性和分子机制进行研究。乳酸乳球菌作为表面展示外源蛋白的理想菌株有其独特的优势：首先，其自身分泌的蛋白质少，胞外蛋白酶的活性低，目的蛋白质的表达不会受到乳酸乳球菌自身蛋白质的影响；其次，抗原性弱，不会产生内毒素，进入人体不会引起强烈的免疫应答；最后，乳酸乳球菌不在胃肠道内定殖，可以避免因其长期定殖而导致的免疫耐受(冯金，乳酸乳球菌表面展示技术，生命的化学，2013,33(1):91-95)。因此乳酸乳球菌现已作为一种食品级表达宿主用于表达和表面展示各种抗原、生长因子以及功能蛋白(RibeiroLA,etal.ProductionandtargetingoftheBmedhabortusantigenL7/L12inLactococcuslactis:afirststeptowardsfood-gradelivevaccinesagainstBrucellosis,AppliedandEnvironmentalMicrobiology2002,68(2):910-916)。但利用乳酸菌表达外源基因存在表达量低，重组乳酸菌会引入外源基因，使用抗生素作为筛选标记会引入抗性基因等一些不容忽视的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种表面锚定有人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌制备方法，首次在大肠杆菌中高效表达可以锚定在乳酸乳球菌表面的功能性人I型金属硫蛋白(hMT)，细菌破碎后不需经过纯化等繁琐的步骤即可将hMT锚定至食品级乳酸菌表面。同时本专利技术提供一种锚定hMT后的乳酸乳球菌，该乳酸乳球菌不携带任何抗性基因与外源基因，因此可安全地应用于食品、保健品和化妆品等行业。为能简单高效地获得锚定有hMT的乳酸乳球菌，并使其能大规模应用，本专利技术技术方案如下：一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌制备方法，包括如下步骤：(1)构建含锚定单元的人I型金属硫蛋白的重组融合表达载体：通过重叠PCR将cA基因与hMT基因拼接，两基因之间引入linker，N端引入促表达标签，得到重组cA-hMT基因；cA基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，hMT基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，linker的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；(2)将重组cA-hMT基因和表达载体pET21a连接，得到的连接产物pET21a-cA-hMT转化至大肠杆菌感受态细胞；(3)将步骤(2)得到的工程菌诱导表达重组融合蛋白cA-hMT，收获菌体后超声破碎细胞，上清液直接和乳酸乳球菌孵育，融合蛋白cA-hMT无需纯化则锚定至菌体表面。步骤(2)重组蛋白表达时为提高可溶蛋白表达量，还需加入分子伴侣，具体步骤如下：将步骤(2)所述的连接产物pET21a-cA-hMT和含有分子伴侣的表达载体先后转化至大肠杆菌的表达菌株。所述分子伴侣为dnaK，dnaJ，grpE，groES和groEL中的一种或两种以上。除湿菌体可直接锚定外，对所述乳酸乳球菌的湿菌体加醋酸(pH＝1)处理并煮沸30min，PBS洗涤后再与重组融合蛋白cA-hMT进行锚定，可显著提高重组融合蛋白锚定至乳酸菌的效率。步骤(3)诱导工程菌表达重组融合蛋白cA-hMT的步骤如下：a.将工程菌接种于含氨苄青霉素和氯霉素的液体LB培养基，于37℃、180rpm振摇过夜，然后按1：100的比例接种于含有氨苄青霉素、氯霉素、L-阿拉伯糖的液体LB培养基中，当OD达0.4～0.8时加入终浓度为0.5～1.0mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，于200rpm，低温继续培养12h后收集菌液，离心，去除上清液；b.用PBS缓冲液洗涤步骤a所得菌体2次，用细菌裂解液重悬，置于冰浴下超声破碎，取超声后的匀浆物离心，分别收集上清液和包涵体。步骤(3)将融合蛋白cA-hMT锚定到乳酸乳球菌表面的步骤如下：将上清液与乳酸乳球菌重悬，室温静置1h，9000g离心2min弃上清，沉淀用PBS溶液洗涤3次，重悬至4℃保存。步骤(3)所述乳酸乳球菌为乳球菌MG1363、MG1614、LM0230、粪肠球菌FA2-2、OGIX或植物乳杆菌。所述乳酸乳球菌的培养步骤如下：将乳酸乳球本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建含锚定单元的人I型金属硫蛋白的重组融合表达载体：通过重叠PCR将cA基因与hMT基因进行拼接，两基因之间引入linker，N端引入促表达标签，得到重组cA‑hMT基因；cA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，hMT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；(2)将重组cA‑hMT基因连接至表达载体pET21a，再将得到的连接产物pET21a‑cA‑hMT转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，经过鉴定得到工程菌；(3)将步骤(2)得到的工程菌诱导表达融合蛋白cA‑hMT，收获菌体后超声破碎，将上清液直接与乳酸乳球菌室温孵育，融合蛋白cA‑hMT则锚定到乳酸乳球菌表面。

【技术特征摘要】
1.一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建含锚定单元的人I型金属硫蛋白的重组融合表达载体：通过重叠PCR将cA基因与hMT基因进行拼接，两基因之间引入linker，N端引入促表达标签，得到重组cA-hMT基因；cA基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，hMT基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，linker的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；(2)将重组cA-hMT基因连接至表达载体pET21a，再将得到的连接产物pET21a-cA-hMT转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，经过鉴定得到工程菌；(3)将步骤(2)得到的工程菌诱导表达融合蛋白cA-hMT，收获菌体后超声破碎，将上清液直接与乳酸乳球菌室温孵育，融合蛋白cA-hMT则锚定到乳酸乳球菌表面。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的重组表达还需加入分子伴侣，具体步骤如下：将步骤(2)所述的连接产物pET21a-cA-hMT和含有分子伴侣的表达载体先后转化至大肠杆菌的表达菌株。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分子伴侣为dnaK，dnaJ，grpE，groES和groEL中的一种或两种以上。4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌还经如下预处理：将乳酸乳球菌湿菌体加醋酸处理并煮沸30min，PBS洗涤后再与重组融合蛋白cA-hMT进行锚定。5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)工程菌诱导...

【专利技术属性】
技术研发人员：王菊芳，马毅，李杉，苏艳芳，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44