基于金属钌多吡啶配合物的三聚氰胺荧光光谱检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于金属钌多吡啶配合物的三聚氰胺荧光光谱检测方法。利用三聚氰胺可以和富含胸腺嘧啶的DNA形成特殊的三个氢键作用，从而使DNA由单链转变为三链，由于[Ru(phen)2dppz-idzo]2+(phen为1,10-邻菲罗啉，dppz为双吡啶并吩嗪，idzo为咪唑啉酮)对三链DNA的强插入作用，造成的荧光增强幅度明显强于单链DNA。当三聚氰胺的浓度为0-7.0μmol/L时，三聚氰胺的浓度与荧光响应值有良好的线性关系，线性回归方程分别为：F＝199.96+85.41c(c:μmol/L)，线性系数R2为0.9923。同时应用所建立的方法在纯牛奶样品中加入不同浓度的三聚氰胺，得到满意的回收率。

【技术实现步骤摘要】
基于金属钌多吡啶配合物的三聚氰胺荧光光谱检测方法
本专利技术涉及一种三聚氰胺的检测方法，尤其是涉及一种基于金属钌多吡啶配合物的三聚氰胺荧光光谱检测方法。
技术介绍
三聚氰胺(C3H3N6)，是一种白色单斜晶体，俗称为密胺或者蛋白精，是一种重要的氮杂环有机化工原料，通常被广泛的应用于防火材料。三聚氰胺不是食品添加剂，不允许加入到食品和动物饲料中。但近年来不法分子为提高奶粉的含氮量在婴幼儿奶粉中加入三聚氰胺，掺有三聚氰胺的奶粉导致多名婴幼儿发生泌尿系统疾病，导致众多的婴幼儿身体健康出现问题，并有死亡病例。通常，食品中蛋白质含量的检测方法为—凯氏定氮法，该方法是通过检测食品中氮的含量来确定蛋白质的当量。蛋白质主要是由氨基酸组成的，而蛋白质的平均含氮量是16％左右，而三聚氰胺的含氮量达到了67％左右。由于凯氏定氮法的存在的不足，一些不法商人将三聚氰胺作为食品添加剂添加入食品及相关产品中(如婴幼儿配方奶粉、牛奶、酸奶、宠物饲料等，以提高产品中氮的检测含量降低产品成本。而三聚氰胺作为一种白色晶体，无味，使得三聚氰胺添加入食品中后不易被发现，从而劣质的食品通过了检验机构的检验。三聚氰胺不能在体内代谢，过多的摄入这种食品不但会引起肾结石，而且还会因为蛋白质摄入不足引起营养不良。所以，必须严格控制三聚氰胺在奶制品和其它食品中使用。如何快速、高效、准确进行三聚氰胺的检测是人民健康安全的第一保证。目前三聚氰胺的检测主要有毛细管电泳法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱/液相色谱串联质谱法(LC/GC-MS)、酶联免疫法(ELISA)、电化学方法、纳米材料比色法。目前荧光光谱法检测三聚氰胺还比较少的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于金属钌多吡啶配合物的三聚氰胺荧光光谱检测方法。本专利技术利用三聚氰胺可以和富含胸腺嘧啶的DNA形成特殊的三个氢键作用，从而使DNA由单链转变为三链，由于[Ru(phen)2dppz-idzo]2+对三链DNA的强插入作用，造成的荧光增强幅度明显强于单链DNA。根据三聚氰胺的浓度与荧光响应值的关系，确定线性关系。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于金属钌多吡啶配合物的三聚氰胺荧光光谱检测方法，包括以下步骤：(1)制作三聚氰胺浓度与荧光强度响应的标准曲线：(1.1)在不同梯度的三聚氰胺标准液中，分别加入富含胸腺嘧啶的DNA(简称富TDNA)，用缓冲液稀释后，在室温下孵化一段时间；(1.2)将金属钌多吡啶配合物加入步骤(1.1)所得混合物中，室温下培养；(1.3)将步骤(1.2)所得混合液震荡，混合均匀后，移入比色皿中进行荧光测定；(1.4)做出三聚氰胺浓度与荧光强度响应的标准曲线；(2)待测样品三聚氰胺浓度的测定：(2.1)在待测样品中，加入富含胸腺嘧啶的DNA，用缓冲液稀释后，在室温下孵化一段时间；(2.2)将金属钌多吡啶配合物加入步骤(2.1)所得混合物中，室温下培养；(2.3)将步骤(2.2)所得混合液震荡，混合均匀后，移入比色皿中进行荧光测定；(2.4)根据测得的荧光强度以及步骤(1.4)所得的标准曲线，得出待测样品中三聚氰胺浓度。优选地，所述的富含胸腺嘧啶的DNA序列从5’-3’为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，命名为T30。优选地，所述的富含胸腺嘧啶的DNA在加入三聚氰胺后的终浓度为1.5μmol/L。优选地，所述的缓冲液为10mmol/LTris-HCl，pH为7.0。所述的金属钌多吡啶配合物化学式为[Ru(phen)2dppz-idzo]2+，其中，phen为1,10-邻菲罗啉，dppz为双吡啶并吩嗪，idzo为咪唑啉酮。优选地，所述的金属钌多吡啶配合物最终浓度为3.0μmol/L。优选地，步骤(1.1)中，三聚氰胺标准液的浓度依次为0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，14.0和16.0μmol/L。步骤(1.3)与步骤(2.3)中，进行荧光测定的条件相同，优选为：测量类型为Wavelengthscan，激发波长为405nm，扫描范围为500-800nm，数据点采集间隔1nm，激发和发射狭缝均为10nm。优选地，室温下孵化或培养的时间为15分钟。优选地，进行荧光测定前，样品总体体积为1mL，比色皿横截面为10mm×10mm。由于金属钌多吡啶配合物具有良好的光化学、光物理性能和丰富的谱学性质，以及独特的DNA键合能力，在DNA分子光开关、DNA结构探针、DNA介导的电荷转移、DNA足迹试剂、DNA断裂试剂及抗癌药物等方面有着广泛的应用，在生物无机化学、材料化学、分析化学，及理论化学等领域中引起了极大关注，成为十分活跃的前沿与交叉研究领域。本专利技术利用的金属钌多吡啶配合物具有很优异的DNA分子光开关效应。关于其分子光开关效应机制目前认可度较高的观点认为，此类钌配合物的光开关效应得益于其自身存在的两个不同的电荷迁移跃迁(MLCT)能态。在非质子溶剂中，最低能态是“明态”(brightstate,BS)，主要和配体的phen部分有关(包括dppz中的双吡啶部分)，此时在激发光存在的条件下通常能够观察到荧光或磷光，因为激发态电子从BS迁回基态时以光辐射的形式放出能量。在质子溶剂中，配体吩嗪(phenazine,phz)部分的N原子与溶剂发生氢键作用使得“暗态”(darkstate,DS)的能量下降至低于BS的能量，此时配合物将不再发光，激发态电子将以振动弛豫的形式返回基态。由于三聚氰胺可以和富TDNA序列形成特殊的三个氢键作用，从而使DNA由单链转变为三链，由于[Ru(phen)2dppz-idzo]2+对三链DNA的强插入作用，造成的荧光增强幅度明显强于单链DNA，该配合物用于三聚氰胺的检测。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：1、本专利技术实现了三聚氰胺检测的步骤简单、过程快速、反应灵敏。2、本专利技术的方法为免标记的荧光检测，省去了DNA荧光标记标记的复杂过程及昂贵费用，检测成本低。3、本专利技术灵敏度高，选择性好。4、本专利技术实现了对实际纯牛奶样品的检测，具有实际应用意义。6、本专利技术的方法具有条件温和、节能高效、易于控制等特点。附图说明图1为三聚氰胺、富含胸腺嘧啶的DNA及[Ru(phen)2dppz-idzo]2+作用原理图。图2为实施例1中，室温时在10mmol/LTris-HCl(pH为7.0)缓冲液里，[Ru(phen)2dppz-idzo]2+-T30在不同的三聚氰胺浓度(0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0,12.0,14.0和16.0μmol/L)存在下的荧光光谱图(激发波长为405nm)。图3为实施例1中，室温时在10mmol/LTris-HCl(pH为7.0)缓冲液里，[Ru(phen)2dppz-idzo]2+-T30在不同的三聚氰胺浓度(从下至上依次为0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0,12.0,14.0和16.0μmol/L)存在下的荧光强度曲线(激发波长为405nm，发射波长为610nm)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于金属钌多吡啶配合物的三聚氰胺荧光光谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制作三聚氰胺浓度与荧光强度响应的标准曲线：(1.1)在不同梯度的三聚氰胺标准液中，分别加入富含胸腺嘧啶的DNA，用缓冲液稀释后，在室温下孵化一段时间；(1.2)将金属钌多吡啶配合物加入步骤(1.1)所得混合物中，室温下培养；(1.3)将步骤(1.2)所得混合液震荡，混合均匀后，移入比色皿中进行荧光测定；(1.4)做出三聚氰胺浓度与荧光强度响应的标准曲线；(2)待测样品三聚氰胺浓度的测定：(2.1)在待测样品中，加入富含胸腺嘧啶的DNA，用缓冲液稀释后，在室温下孵化一段时间；(2.2)将金属钌多吡啶配合物加入步骤(2.1)所得混合物中，室温下培养；(2.3)将步骤(2.2)所得混合液震荡，混合均匀后，移入比色皿中进行荧光测定；(2.4)根据测得的荧光强度以及步骤(1.4)所得的标准曲线，得出待测样品中三聚氰胺浓度。

【技术特征摘要】
1.一种基于金属钌多吡啶配合物的三聚氰胺荧光光谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制作三聚氰胺浓度与荧光强度响应的标准曲线：(1.1)在不同梯度的三聚氰胺标准液中，分别加入富含胸腺嘧啶的DNA，用缓冲液稀释后，在室温下孵化一段时间；(1.2)将金属钌多吡啶配合物加入步骤(1.1)所得混合物中，室温下培养；(1.3)将步骤(1.2)所得混合液震荡，混合均匀后，移入比色皿中进行荧光测定；(1.4)做出三聚氰胺浓度与荧光强度响应的标准曲线；(2)待测样品三聚氰胺浓度的测定：(2.1)在待测样品中，加入富含胸腺嘧啶的DNA，用缓冲液稀释后，在室温下孵化15分钟；(2.2)将金属钌多吡啶配合物加入步骤(2.1)所得混合物中，室温下培养；(2.3)将步骤(2.2)所得混合液震荡，混合均匀后，移入比色皿中进行荧光测定；(2.4)根据测得的荧光强度以及步骤(1.4)所得的标准曲线，得出待测样品中三聚氰胺浓度。2.根据权利要求1所述的一种基于金属钌多吡啶配合物的三聚氰胺荧光光谱检测方法，其特征在于，所述的富含胸腺嘧啶的DNA序列从5’-3’为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT。3.根据权利要求1所述的一种基于金属钌多吡啶配合物的三聚氰胺荧光光谱检测方法，其特征在于，所述的富含胸腺嘧啶的DNA在加入三聚氰胺后...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘冰，张艺伟，王秀枝，姚天明，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海;31