微生物分析的设备和方法技术

对从培养物中分离之后或直接来自样品的微生物进行鉴定的方法和系统。该方法和系统基于经高分辨率/质量准确性的单级(MS)或多级(MSn)质谱而对微生物蛋白质进行的表征来鉴定微生物。本公开还包括：通过采用适用于基本所有微生物的方法和高分辨率/质量准确性的单级(MS)或多级(MSn)质谱，来对毒力因子、抗生素耐受性标记物、抗生素敏感性标记物、分型或其它特征进行目标检测和评估的讨论。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用该申请要求于2013年4月30日提交、申请序列号是No.13/874213的美国专利申请“Apparatus and methods for microbiological analysis”的优先权。该申请还要求于2012年5月1日提交的，专利技术人是James L.Stephenson、Jr.，Oksana Gvozdyak、Roger Grist、Clay Campbell和Ian D.Jardine，申请序列号是No.61/687785的美国临时专利申请“Apparatus and methods for microbial analysis and directed empiric therapy”的优先权，通过引用将其全文结合至本公开。
技术介绍
近年来，质谱分析与传统的鉴定微生物的方法相比，由于其准确性提高，获得结果的时间缩短，成为流行的鉴定微生物的手段。到目前为止，微生物鉴定中最常用的质谱分析方法是基质辅助的激光解吸附离子化时间飞行(MALDI-TOF)质谱分析。在MALDI-TOF中，未知微生物细胞与合适的紫外光吸收基质溶液混合，并在样品板上干燥。或者，用微生物细胞的提取物取代完整细胞。转移至质谱仪的离子源之后，激光束照射至样品进行蛋白质的解吸附和离子化，并收集随时间变化的质谱数据。MALDI-TOF法产生的微生物的质谱显示了来自完整肽、蛋白质和蛋白质片段的大量尖峰，其构成了该微生物的“指纹”。该方法依赖于未知微生物的质谱尖峰图与参考数据库的匹配，所述参考数据库包括采用基本相同的实验条件所获得的已知微生物的图谱集合。分离的微生物和参考数据库中的某个图谱的匹配越好，则将该微生物鉴定是属、种、(或在某些情况下)亚种级的可信度就越高。由于该方法依赖于MALDI-TOF质谱中尖峰图的匹配，其不需要鉴定或者另外表征在该未知微生物图谱中表示的蛋白质以鉴定该微生物。尽管MALDI-TOF法快速、成本高效，其仍然具有缺陷从而限制了其应用范围。基质辅助激光解吸附离子化(MALDI)质谱中的信息内容反映了含量最高的、可离子化的蛋白质，除了病毒，在所采用的实验条件下，所述蛋白质通常局限于核糖体蛋白质。由于核糖体蛋白质在原核生物中是高度保守的(conserved)，因此，MALDI-TOF对紧密相关的微生物的区分是有限的。而且，株型鉴定(strain identification)和/或血清型鉴定、抗生素耐受性、抗生素敏感性、毒力(virulence)或其它重要特征的确定取决于蛋白质标记物而不是核糖体蛋白质的检测，其进一步限制了MALDI-TOF在微生物分析中的应用。采用MALDI-TOLF鉴定微生物的实验室必须采用其它方法以进一步表征被鉴定的微生物。另外，MALDI-TOF法对质谱形状匹配的依赖要求纯的培养物，以获得高质量结果，其通常不适用于直接测试含有不同微生物的样品。已经采用了若干其它的质谱分析法以检测微生物。例如，已经描述了基于质谱的蛋白质测序方法，其中液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)，从源自微生物样品的蛋白质的酶分解物获得序列信息。该方法，称为“由下至上(bottom-up)”的蛋白质组学是被广泛应用的蛋白质鉴定方法。该方法可以提供亚种或株型级的鉴定，这是因为，色谱分离允许对核糖体蛋白质之外的其它蛋白质进行检测，包括有利于对抗生素耐受性标记物和毒力因子进行表征的蛋白质。所述由下至上的方法的主要缺陷是获得结果的时间延长，这是因为，需要对蛋白质进行分解、长时间的色谱分离和数据处理。因此，该方法不适用于高产出量处理。
技术实现思路
本专利技术包括一种用于在从培养物分离之后或者直接从样品对微生物进行鉴定的新方法和系统，其中所述方法和系统是基于通过高分辨率/质量准确性的单级(MS)或多级(MSn)质谱来对微生物的蛋白质进行表征。本公开采用基本适用于几乎所有微生物的方法和高分辨率/质量准确的单级(MS)或多级(MSn)质谱，还讨论了对毒力因子、抗生素耐受性标记物、抗生素敏感性标记物或其它特征的目标检测和评估。尽管以下讨论集中于通过蛋白质表征来鉴定微生物，但是本公开所述的方法和系统同等适用于通过对一种或多种小分子、脂类或碳水化合物等的表征来鉴定微生物。一方面，本专利技术提供了一种传统由下至上蛋白质组学方法的替代方法，即通过基本适用于几乎所有微生物的方法对源自微生物细胞的完整蛋白质进行由上至下(top-down)的分析，所述微生物包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、分枝杆菌、支原体、酵母菌、病毒和丝状(即显微镜可见的)真菌。本专利技术提供了对含有微生物混合物的样品中的微生物在属、种、亚种、致病株型、甚至是血清型级的鉴定，和/或对直接来自纯的和/或混合培养物以及直接样品(例如表面拭子、体液等)的微生物进行鉴定。另外，可以采用该方法对毒力因子、抗生素耐受性和敏感性标记物或其它特征进行目标检测。本专利技术的方法简单且快速，这是因为，不需要对样品进行化学或酶分解，而且实时进行数据处理。示例性方法包括两阶段工艺。在第一阶段，样品中微生物的可溶蛋白质被快速提取，并经质谱仪分析，以便基于对一种或多种被提取的可溶蛋白质的分子量和片段分析来鉴定微生物。第一阶段在几分钟之内完成，例如少于10分钟，少于5分钟或大约1分钟之内或更少。第二阶段采用快速色谱(rapid,time-compressed chromatography)分离和质谱分析(例如目标MS和MSn)以进一步表征在第一步中鉴定的微生物，例如通过确定毒力因子、抗生素耐受性标记物、抗生素敏感性标记物或其它特征来表征。第二阶段在几分钟之内完成，例如少于15分钟，少于10分钟，或大约5分钟之内或更少。两个阶段均依靠对源自微生物的完整蛋白质的检测和鉴定，不需要将蛋白质进行化学、物理或酶降解至它们的取代肽。对样品中一种或多种微生物进行鉴定和表征的另一示例性方法包括以下步骤：(a)采用质谱分析进行第一分析方法，以对一种或多种微生物中的每一个检测和鉴定一种或多种(例如，一、二、三、四、五种或更多)蛋白质；(b)利用上述来自一种或多种微生物中的每一个的一种或多种蛋白质的身份，进一步确定样品中的至少一种微生物；(c)利用来自步骤(b)的信息从预定义的分析方法列表中自动选择第二分析方法，第二分析方法也采用质谱分析；以及(d)对样品执行第二分析方法，以确定样品中是否存在指示抗生素耐受性标记物、抗生素敏感性标记物和/或毒力因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定一种或多种微生物的方法，包括：a.提供含有一种或多种微生物的样品；b.将所述样品中的所述一种或多种微生物破碎，以提供流体提取物；c.将所述流体提取物中的可溶蛋白质部分与不可溶蛋白质部分分离，制备所述可溶蛋白质部分的溶液；d.将所述可溶蛋白质部分的溶液的流体离子化，以形成一种或多种离子化蛋白质；e.用质谱仪分析所述一种或多种离子化蛋白质，其中所述分析包括：i.在第一质谱分析步骤中，获取代表所述样品中一种或多种可溶蛋白质的一个或多个质谱；ii.由所述一个或多个质谱确定所述蛋白质的分子量；iii.采用所确定的分子量，来搜索含有已知微生物蛋白质的分子量的第一数据库，并从所述数据库中选择候选的微生物子集；iv.在第二质谱分析步骤中，从所述样品的所述一种或多种离子化蛋白质中选择一种或多种蛋白质前体离子，以及通过裂解方式将所述前体离子裂解，以产生多种产物离子；以及V.采用所述多种产物离子的质量‑电荷比来搜索第二数据库，其中所述第二数据库含有已知微生物蛋白质的分子量和至少一种产物离子m/z比值、氨基酸序列、或所述已知微生物蛋白质的翻译后修饰信息，其中，来自所述第一数据库的所述候选的微生物子集用于限定所述第二数据库的搜索；以及f.采用步骤(e)中获得的关于所述样品中所述一种或多种微生物中的每一个微生物的一种或多种蛋白质的信息，来鉴定至少一个所述微生物。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.01 US 61/687,785;2013.04.30 US 13/874,2131.一种鉴定一种或多种微生物的方法，包括：
a.提供含有一种或多种微生物的样品；
b.将所述样品中的所述一种或多种微生物破碎，以提供流体提取物；
c.将所述流体提取物中的可溶蛋白质部分与不可溶蛋白质部分分离，制
备所述可溶蛋白质部分的溶液；
d.将所述可溶蛋白质部分的溶液的流体离子化，以形成一种或多种离子
化蛋白质；
e.用质谱仪分析所述一种或多种离子化蛋白质，其中所述分析包括：
i.在第一质谱分析步骤中，获取代表所述样品中一种或多种可溶蛋
白质的一个或多个质谱；
ii.由所述一个或多个质谱确定所述蛋白质的分子量；
iii.采用所确定的分子量，来搜索含有已知微生物蛋白质的分子量的
第一数据库，并从所述数据库中选择候选的微生物子集；
iv.在第二质谱分析步骤中，从所述样品的所述一种或多种离子化蛋
白质中选择一种或多种蛋白质前体离子，以及通过裂解方式将所述前体离子
裂解，以产生多种产物离子；以及
V.采用所述多种产物离子的质量-电荷比来搜索第二数据库，其中所
述第二数据库含有已知微生物蛋白质的分子量和至少一种产物离子m/z比
值、氨基酸序列、或所述已知微生物蛋白质的翻译后修饰信息，其中，来自
所述第一数据库的所述候选的微生物子集用于限定所述第二数据库的搜索；
以及
f.采用步骤(e)中获得的关于所述样品中所述一种或多种微生物中的
每一个微生物的一种或多种蛋白质的信息，来鉴定至少一个所述微生物。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)对革兰氏阳性菌、革兰氏
阴性菌、酵母、病毒、分枝杆菌和丝状真菌有效。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述离子化是电喷雾离子化。
4.如权利要求1所述的方法，其中在所述第一质谱分析步骤中，针对所
述样品中所述一种或多种蛋白质的所述质谱的质量准确性是至少为15ppm
或更好。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述裂解方式是碰撞诱导解离。
6.如权利要求1所述的方法，其中在所述第二质谱分析步骤中，所述产
物离子的所述质荷比的质量准确性是15ppm或更好。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述可溶蛋白质溶液直接流入离
子化设备，不需要色谱分离。
8.一种鉴定一种或多种微生物的方法，包括：
a.提供怀疑含有一种或多种微生物的样品；
b.将所述样品中的所述一种或多种微生物破碎，以提供流体提取物；
c.将所述流体提取物中的可溶蛋白质部分与不可溶蛋白质部分分离，以
及制备所述可溶蛋白质部分的溶液；
d.将所述可溶蛋白质部分的溶液的流体离子化，以形成一种或多种离子
化蛋白质；
e.用质谱仪分析所述一种或多种离子化蛋白质，其中所述分析包括：
i.在第一质谱分析步骤中，获取代表所述样品中一种或多种可溶蛋
白质的一个或多个质谱；
ii.由所述一个或多个质谱确定所述蛋白质的分子量；
iii.采用所确定的分子量，来搜索含有已知微生物蛋白质的分子量的
第一数据库，并从所述数据库中选择候选的微生物子集；
iv.在第二质谱分析步骤中，从所述样品的所述一种或多种离子化蛋
白质中选择一种或多种蛋白质前体离子，以及通过裂解方式将所述前体离子
裂解，以产生多种产物离子；以及
V.采用所述多种产物离子的质量-电荷比来搜索第二数据库，其中所
述第二数据库含有已知微生物蛋白质的分子量和至少一个氨基酸序列或所
述已知微生物蛋白质的翻译后修饰信息，其中，来自所述第一数据库的所述
候选的微生物子集用于限定所述第二数据库的搜索；以及
f.自动分析足够数量的蛋白质，以鉴定所述样品中所述一种或多种微生
物中的至少一个。
9.如权利要求1所述的方法，其中采用自动仪器执行步骤(b)-(f)。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述第一质谱分析步骤或第二质谱
分析步骤中的至少一个包括：从质量范围窗口中选择所述一种或多种前体离

\t子，以及重复所述第二质谱分析步骤，直至覆盖了足够数量的质量范围窗口，
以鉴定所述样品中所述一种或多种微生物中的至少一个。
11.一种鉴定和表征一种或多种微生物的方法，包括：
a.提供含有一种或多种微生物的第一等份样品；
b.将所述第一等份中的所述一种或多种微生物破碎，以提供流体提取
物；
c.将所述流体提取物中的第一可溶蛋白质部分与不可溶蛋白质部分分
离，以及制备所述可溶蛋白质部分的第一溶液；
d.将所述可溶蛋白质部分的第一溶液的流体离子化，以形成一种或多种
第一离子化蛋白质；
e.用质谱仪分析所述一种或多种第一离子化蛋白质，其中所述分析包
括：
i.在第一质谱分析步骤中，获取代表所述样品中一种或多种可溶蛋
白质的一个或多个第一质谱；
ii.基于所述一个或多个第一质谱，来确定所述可溶蛋白质的分子量；
iii.采用所确定的分子量，对含有已知微生物蛋白质的分子量的第一
数据库进行第一搜索，以及基于所确定的所述样品中可溶蛋白质的分子量，
从所述第一数据库中选择候选的微生物第一子集；
iv.在第二质谱分析步骤中，选择所述一种或多种第一离子化蛋白质
的一种或多种第一前体离子，以及通过裂解方式将所述第一前体离子裂解，
以产生第一多种第一产物离子；
V.采用所述第一多种第一产物离子的质量-电荷比来对第二数据库
进行第一搜索，其中所述第二数据库含有已知微生物蛋白质的分子量和至少
一种产物离子m/z比值、氨基酸序列或所述已知微生物蛋白质的翻译后修饰
信息，其中，来自所述第一数据库的所述候选的微生物第一子集用于限定所
述第二数据库的所述第一搜索；以及
f.采用步骤(e)中获得的关于所述样品中所述一种或多种微生物中每
一个微生物的一种或多种可溶蛋白质的信息，以鉴定至少一个微生物至种属
级；
g.采用来自步骤(f)的信息，从预定义的分析方法列表中自动选择第

\t二分析方法，其中所述第二方法也采用质谱分析；
h.提供第二等份的流体提取物...

【专利技术属性】
技术研发人员：小詹姆斯·L·斯蒂芬森，O·沃兹达科，R·格斯特，C·坎贝尔，I·D·贾丁，I·C·莫尔科利斯特，
申请(专利权)人：奥克索伊德有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB