一种高密度RGD肽修饰材料的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种高密度RGD肽修饰材料的制备方法及应用，将表面带活性基团修饰的材料分散于甲苯中，加入催化量的4-二甲氨基吡啶，冰浴下缓慢滴加入三乙胺及2-溴异丁酰溴制得引发剂。向产物中加入溴化亚铜,2-2联吡啶和聚乙二醇甲基丙烯酸酯得大分子聚合物。向反应物中加入活化试剂和4-二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中，得活化的聚合物刷，加入RGD肽在室温条件在避光反应18小时。将细胞移入至含RGD肽修饰的聚合物刷中，以磷酸盐缓冲液为悬浮液，4℃下在摇床上反应20分钟，即得到高密度RGD肽修饰材料。该方法反应条件温和，步骤简便易行，实现了将细胞高浓度、高密度地固定在固体材料表面的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学领域，应用含RGD肽的聚合物刷涂层对固体材料表面进行修 饰，将细胞固定在材料表面，具体为一种高密度RGD肽修饰材料的制备方法及应用。
技术介绍
生物细胞固定化技术是指利用化学或物理的手段将细胞自然固定或定位于限定 的空间区域内，保持其固有的催化活性，并能反复使用。固定化生物细胞能持续增殖、休 眠及衰亡，其活性始终保持稳定。固定化的生物细胞除保持其原有的识别、结合和催化活 性外，还具有易于分离、可重复使用及稳定性提高等显著的优点。如果能将与细胞具有亲 和力的固体材料作为一种生物医用材料，在组织器官受损时植入体内，能够修复受损组织 的正常功能，大大减少机体对于植入物的不良反应，同时使术后痊愈的速度大大加快。 起初，外科学是以切开、切除病变组织为治病的主要手段，而当人体组织、器官因 病伤损毁，无法用现有的医疗手段修复其功能时，则可以用植入一种组织或器官的方法，取 代病损组织器官的功能，保持机体的正常生命活动。人体组织器官的更换有两种，一种是同 种异体组织器官的移植，如肾移植、心脏移植、肝脏移植、角膜移植等，而目前在世界各国， 供体器官的来源有限都是限制异体器官移植的一大瓶颈；而另一种方法是是人造器官和组 织移植，如人工心脏瓣膜的植入、人工血管的移植、人工关节的植入、人工骨的植入以及人 工晶体的植入等。而人造器官的置换由于科学技术的进步，人造器官的结构和功能也在不 断改近提高，已成功地在临床推广应用，显著地提高了临床治疗水平。 人造器官从本质看，是用人工材料制造的一种医疗器件或仪器，它们具有一种部 分或全部替代人体自然器官的功能。而对于植入生物活体内的高分子材料，一般应具有两 种基本性能，即医用功能性和生物相容性。医用功能性是指材料在与生物体组织相结合后 能达到诊断或医疗的效果；而生物相容性是指材料和活体组织之间相互容纳的程度。无论 什么材料植入人体，对机体内生物环境来说，它都是人体组织之外的一种异物，对于机体组 织细胞均会产生不同程度的物理化学因素刺激，如引起结缔组织增生、组织钙化等变化。同 时机体的神经、体液系统内环境对植入的生物材料也会产生一系列侵蚀影响和排异反应， 这是机体固有的一种防御机制。若这种排斥反应对机体生理功能、对材料本身的物理及化 学性状造成了较严重的影响，甚至引起人工器官的功能丧失，严重的威胁到人体健康，那么 这种材料将无法应用于临床治疗。固定化细胞是指细胞受到物理化学等因素被约束或限制 在一定的空间范围内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。目前， 这项技术已经广泛应用于发酵、制药、环境保护等领域。常用的细胞固定方法有吸附法、包 埋法、交联法、共价结合法、絮凝法等。包埋法将细胞定位于凝胶网格内或聚合物半透膜微 胶囊中，形成的结构可以防止细胞渗漏，但允许底物进入、产物扩散出。其缺点是扩散阻力 大、不适合催化大分子底物与产物的反应；共价结合法依靠细胞表面上功能团和固相支持 物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，该方法细胞与载体结合紧密、不易脱落，但是 反应剧烈、条件难控制、细胞活性损失大、制备较难；交联法该方法主要是通过多功能试剂 与细胞表面的基团（如巯基、羟基、氨基等）发生化学反应形成共价键，实现细胞的固定化。 该方法的突出特点是细胞与载体结合紧密，但化学反应剧烈，使细胞活性大大降低，制备麻 烦；吸附法是细胞与载体间通过物理吸附或离子作用结合将细胞固定在载体上的方法。该 方法操作简单，对细胞的影响小，但是吸附力小、细胞易脱落。在传统的细胞固定化方法中， 通过吸附作用固定细胞时，一般结合能力弱，细胞易脱落；而通过共价键作用将细胞固定的 方法则对细胞伤害大，无法保持细胞活性。 因此满足体内植入材料的首要条件，就是其生物相容性要高。生物系统对生物相 容性的影响包括生物体种类、植入部位、受体的健康状况、埋植留存时间、使用的生理环境 等。一般说来，材料与生物体相互作用的反应主要集中于固体生物材料与体液接触形成的 固一液界面上。聚合物刷是指高分子链一端固定在某个界面上而形成的一种聚合物组装结 构，本专利技术通过一系列化学反应，将含有RGD肽的聚合物刷接枝在固体材料表面，形成薄涂 层。RGD肽是一类含有精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸序列的短肽，存在于多种生物细胞外基质 中，能特异性地识别细胞表面整合素并与之结合，从而介导多种重要的生理过程。而整合素 存在于大多数细胞表面，是一种介导细胞与细胞间的相互作用及细胞与细胞外基质间相互 作用的跨膜受体。通过细胞表面整合素与RGD肽的识别以及相互作用，可以使细胞黏附在 含RGD肽聚合物刷涂层的固体材料表面，将其应用于各类植入人体内的生物医学材料中， 不仅大大增强了材料的生物相容性，降低了免疫排斥反应，而且这种黏附作用，使得体内细 胞在植入材料表面的适应性更好，更易增殖，大大降低了机体的不良反应。而该方法也可作 为一种新型色谱填料的合成方法，在细胞水平上研宄外源性药物分子与其所携带的功能蛋 白质的相互作用。细胞是生物体生命活动的基本反应器，其所携带的功能蛋白质与外源性 药物分子，内源性细胞因子、趋化因子及生长因子的相互作用，是启动和完成后期级联式信 号传导过程的先决条件，也在本质上决定了生物体体内的每一种生理学过程。更为重要的 是，这种复杂的特异性相互作用过程与疾病的病理病机具有密切的关系，也往往被作为依 据进行新药的研发和疾病的治疗。如果能将整个细胞反应器通过特异的抗原抗体生理反应 固定担体表面，作为色谱介质，则不仅能继承经典亲和色谱方法的优点，而且能克服其不能 体现功能蛋白质信号传导过程的不足，从而可通过色谱方法在细胞水平上获得功能蛋白质 与药物配体相互作用和由此所产生的细胞器内生理学过程的更准确、更丰富的信息。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提一种高密度细胞活性固定化的方法，其制备方法反应条件温 和，步骤简便易行，能最大程度地保存细胞完整性与活性，吸附力强，细胞不易脱落。 为实现上述目的本专利技术采用以下技术方案： 一种高密度RGD肽修饰材料的制备方法，包括以下步骤： (1)引发剂的制备 将氨基微球分散于甲苯中，超声10分钟，加入催化量的4-二甲氨基吡啶，冰浴下 缓慢滴加入三乙胺及2-溴异丁酰溴，冰浴下继续搅拌2小时后，升温至室温下搅拌12小时 充分反应，用砂芯漏斗抽滤，依次用干燥二氯甲烷、丙酮、甲醇洗涤后，温度60°C真空下干燥 12小时，制得引发剂； 反应路线如下所示：【主权项】1. 一种高密度RGD肽修饰材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 引发剂的制备 将表面带活性基团修饰的材料分散于甲苯中，超声10分钟，加入催化量的4-二甲氨基 吡啶，冰浴下缓慢滴加入三乙胺及2-溴异丁酰溴，冰浴下继续搅拌2小时后，升温至室温下 搅拌12小时充分反应，用砂芯漏斗抽滤，依次甲苯、丙酮、甲醇洗涤后，温度60°C真空下干 燥12小时，制得引发剂； (2) 聚合物刷的合成 将步骤（1)所得引发剂加入至含有聚乙二醇甲基丙烯酸酯、溴化亚铜、2-2联吡啶和甲 醇甲醇溶剂的混合溶液中，在氮气保护搅拌反应6小时后停止表面转移自由基聚合反应， 用纯水和甲醇依次洗绦； (3) 聚合物刷的活化 将步骤⑵反应所得聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高密度RGD肽修饰材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)引发剂的制备将表面带活性基团修饰的材料分散于甲苯中，超声10分钟，加入催化量的4‑二甲氨基吡啶，冰浴下缓慢滴加入三乙胺及2‑溴异丁酰溴，冰浴下继续搅拌2小时后，升温至室温下搅拌12小时充分反应，用砂芯漏斗抽滤，依次甲苯、丙酮、甲醇洗涤后，温度60℃真空下干燥12小时，制得引发剂；(2)聚合物刷的合成将步骤(1)所得引发剂加入至含有聚乙二醇甲基丙烯酸酯、溴化亚铜、2‑2联吡啶和甲醇甲醇溶剂的混合溶液中，在氮气保护搅拌反应6小时后停止表面转移自由基聚合反应，用纯水和甲醇依次洗涤；(3)聚合物刷的活化将步骤(2)反应所得聚合物刷加入含活化试剂和4‑二甲氨基吡啶的干燥的二甲基甲酰胺溶液中，通入氮气在室温下反应6小时，反应结束后用二甲基甲酰胺溶液洗涤，得活化的聚合物刷；(4)RGD的接枝将活化的聚合物刷放入含有RGD肽和4‑二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中，在室温条件在避光反应18小时，用二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲液依次洗涤，抽滤，即得RGD肽修饰的聚合物刷；(5)细胞的移入将步骤(4)所得RGD肽修饰的聚合物刷保存在磷酸盐缓冲液中，将细胞移入至含RGD肽修饰的聚合物刷中，以磷酸盐缓冲液为悬浮液，温度4℃下在摇床上反应20分钟，即得高密度RGD肽修饰材料。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新锋，郑晓晖，于洁，王世祥，李倩，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61