一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法，取样后离心清洗，然后将聚磷菌PAOs样品置于pH为7.4，体积百分浓度为2.5％的戊二醛溶液中固定；用质量百分浓度为2-10％的Pb(NO3)2溶液对聚磷菌样品进行染色；梯度乙醇-丙酮系列脱水法脱水；树脂浸透与包埋，最后切片；本发明专利技术方法解决了已有方法中样品预处理过程复杂、使用药剂毒性强、PAOs细胞内超微结构难于清晰显示的问题；采用该制样方法制备PAOs样品，在TEM观察中，菌体细胞结构特别是菌体内的poly-Ps能够清晰完整地显现出来。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于TEM超薄切片样品的制备领域，特别涉及。
技术介绍
生物除磷过程中起关键作用的是聚磷菌(phosphorus accumulatingorganisms, PAOs), PAOs的除磷功能与其胞内聚合物如多聚磷酸盐颗粒(poly-Ps)的数量密切相关。鉴于PAOs胞内poly-Ps的重要性，常对其进行定性和定量分析测定，一般通过染色并借助光学或电子显微镜观察PAOs体内poly-Ps的分布情况(聚磷菌胞内聚合物的染色条件优化及染色方法比较.环境科学与技术，2014，(2):1-6)。然而，光学显微镜的分辨率低(仅为0.2 μπι)(电子显微镜的原理和技术.山西农业科学,1980, (01):28-29)，无法清晰观测PAOs体内直径在0.2 μπι以下的poly-Ps，而电子显微镜的分辨率可达I?2nm(透射电子显微镜在矿物加工与利用中的应用.微计算机信息，2010, 34(1): 141-143)，可用于对PAOs体内poly-Ps进行精确地定性及定量观测(耳蜗透射电镜超薄切片样品的制备技术改进.电子显微学报，2011，(I):69-71)。透射电子显微镜(Transmiss1nElectron Microscopy, TEM)是研宄生物超微结构的重要工具(A Filtrat1n Based Technique for Simultaneous SEM andTEM Sample Preparat1n for the Rapid Detect1n of Pathogens.Viruses-Basel, 2014,6(9):3458-3471)。TEM是指把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向产生立体角散射，形成明暗不同的样品影像。TEM样品的制备是准确测定PAOs胞内poly-Ps的重要保障te]。常规的超薄切片技术的制样过程比较复杂，一般包括为固定、清洗、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤(Use of permanentmarker to deposit a protect1n layer against FIB damage in TEM specimenpreparat1n , J Micros。, 2014，255 (3): 180-187)。采用常规 TEM 超薄切片技术制样方法与步骤制备PAOs的TEM样品，往往在电镜下难以准确区分细胞质以及PAOs体内的特征性poly-Ps，且在电镜观测中存在颤痕等问题(TEM preparat1n methods and influenceof radiat1n damage on the beam sensitive CaC03 shell of Emiliania huxleyi.Micron, 2014，62(2):28-36)。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，本专利技术方法解决了现有方法中样品预处理过程复杂、使用药剂毒性强、PAOs细胞内超微结构难于清晰显示的问题，采用该制样方法制备PAOs样品，在TEM观察中，菌体细胞结构特别是菌体内的poly-Ps能够清晰完整地显现出来。本专利技术的，包括:(I)取材及清洗:样品采自经分离、筛选与纯化得到的纯PAOs及实验室运行稳定的厌氧一好氧交替式生物滤池(AABF)中的生物膜；采样后，将PAOs样品(小于Imm3)在I?2min内浸入清洗液中；为防止PAOs细胞自溶，以上过程需在O?4°C低温条件下操作；然后离心清洗。其中清洗液为0.1M的二甲砷酸钠SCB缓冲溶液或生理盐水；为防止清洗过程中磷酸盐(PBS)缓冲溶液中的磷的干扰，采用0.1M的SCB缓冲溶液来代替PBS缓冲溶液，也可用生理盐水(体积百分浓度为0.85 %的NaCl溶液)代替0.1M的SCB缓冲溶液进行清洗，以便维持溶液的pH以及渗透压；(2)固定将聚磷菌PAOs样品置于pH为7.4，体积百分浓度为2.5%的戊二醛溶液中，在4°C且不见光的条件下固定l_2h ;制备PAOs的TEM样品时，只需用2.5 %的戊二醛溶液作为固定剂，其固定过程为:取0.2M的SCB缓冲溶液25ml和体积百分浓度为25%的戊二醛溶液5ml，并滴加重蒸水(ddH2O)至50ml，制成体积百分浓度为2.5%的戊二醛溶液(PH = 7.4)，将所取PAOs样品用0.1M的SCB缓冲溶液充分清洗后，置于体积百分浓度为2.5 %的戊二醛溶液(PH = 7.4)中，于4°C且不见光的环境下固定I?2h。⑶染色用质量百分浓度为2-10%的Pb (NO3)2溶液对聚磷菌PAOs样品进行染色0.5_lh，然后再清洗；常规的细菌TEM制样过程中的染色仅在超薄切片制好后，用3%醋酸铀与枸橼酸铅进行双染色，对PAOs的TEM样品制备若采用该染色方法会造成细胞内所有组成均染成灰色或黑色，很难分辨PAOs体内的poly-Ps。因此，需要在细胞仍具有一定活性时(脱水前)，采用能够与磷形成沉淀的Pb (NO3)2溶液进行染色。由于采用Pb (NO3)2溶液染色后，已经可以清晰分辨电镜所拍摄的poly-Ps，无需在样品包埋切片后继续染色。因此将PAOs包埋切片后染色改为PAOs脱水前染色。不同生存状态下的PAOs的染色要求对于纯培养条件下生长的PAOs和混合培养条件下生长的PAOs，需要采用不同质量百分浓度的Pb (NO3)2溶液(2?10% )进行染色lh，保证Pb (NO3)2溶液能充分渗透进入生物膜内PAOs体内，对poly-Ps染色成功。⑷脱水采用梯度乙醇-丙酮系列脱水法脱水；(5)树脂浸透与包埋用体积比为1:1的丙酮和包埋剂的混合液处理聚磷菌PAOs样品，打开瓶盖，渗透过夜，再加纯包埋剂渗透l_2h(在Imin之内，样品需浸到包埋剂底部，若样品悬浮在树脂中，则要加少许丙酮至样品沉到底部并过夜，第2天换纯包埋剂浸透12?24h)，然后将渗透后的聚磷菌PAOs样品包埋，把包埋剂注入包埋块板孔中，将聚磷菌样品取出，迅速摆放在包埋板孔中，采用梯度升温聚合，聚合后自然降温，最后切片。所述步骤(I)中采集的聚磷菌样品体积小于1mm3。所述步骤(I)中离心清洗速率为4000?5000r/min，离心次数为8-10次，最后一次离心速率为10000r/min。所述步骤(4)中梯度乙醇-丙酮系列脱水法为:先用体积百分浓度分别为30%、50%、70%、90%的乙醇各脱水I次，再用体积比为1:1的100%无水丙酮和100%无水乙醇混合溶液脱水I次，最后用100%无水丙酮脱水3次，每次脱水时间均为20min。所述步骤(5)中包埋剂为环氧树脂618。所述步骤(5)中梯度升温为35°C下保温16h，再升温至45°C，保温24h，然后升温至60°C，保温48h ;升温速率为0.625 0C /h。所述步骤(5)中切片厚度为90_100nmo本专利技术提出了一种适合PAOs的TEM超薄切片样品的制备方法:以0.1M的二甲砷酸钠(SCB)缓冲溶液作为清洗液；以体积百分浓度为2.5%的戊二醛溶液作为固定剂；以Pb (NO3)2溶液作为染色剂、且根据PAOs生长方式控制Pb (NO 3) 2溶液的质量百分浓度在2?10%范围内变动、并将染色步骤从常本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法，包括：(1)0‑4℃条件下，将聚磷菌PAOs样品采集后1‑2min浸入清洗液中，离心清洗；其中清洗液为0.1M的二甲砷酸钠SCB缓冲溶液或生理盐水；(2)将聚磷菌PAOs样品置于pH为7.4，体积百分浓度为2.5％的戊二醛溶液中，在4℃且不见光的条件下固定1‑2h；(3)用质量百分浓度为2‑10％的Pb(NO3)2溶液对聚磷菌样品进行染色0.5‑1h，然后再清洗；(4)梯度乙醇‑丙酮系列脱水法脱水；(5)用体积比为1:1的丙酮和包埋剂的混合液处理聚磷菌样品，渗透过夜，再加纯包埋剂渗透1‑2h，然后将渗透后的聚磷菌样品包埋，把包埋剂注入包埋块板孔中，将聚磷菌样品取出，迅速摆放在包埋板孔中，采用梯度升温聚合，聚合后自然降温，切片。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田晴，倪兵，朱艳彬，杨波，李方，孟丹杰，秦华星，庄林杰，王琦，张成，王康伟，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海;31