使用双级切线流超滤纯化多肽制造技术

本发明专利技术涉及使用双级切线流超滤(“TFF”)从含有目的分子的溶液分离该分子的方法。特别地，本发明专利技术的方法是涉及加工粗制进料流如条件化的细胞培养上清液以在后续(即，下游)提炼单元操作之前大幅度降低污染物水平和/或杂质水平。本发明专利技术的方法可以用于加工来自生物生产系统如发酵或其他细胞培养过程的粗制进料流，并且还可以消除在对高杂质负荷敏感的下游过程如层析单元操作之前对费时的杂质沉淀(例如，pH驱动型)过程和/或沉淀物过滤过程的需要。公开的双级TFF方法联合了可以在下述pH有利实施的至少两个TFF单元操作，所述pH对应于进料流(例如，细胞培养上清液)的pH或大约是该pH，一般是pH7.5±1.0。TFF单元操作补充、改善或替代纯化进料流的目的蛋白的传统过程的用途可以代表明显的直接和间接加工成本节省。例如，除了通过消除沉淀过程和沉淀物过滤过程而间接节约之外，通过双级TFF单元操作实现的杂质荷载降低可以通过改善下游柱性能，例如，层析分离、动态结合容量、运行寿命和/或所需的柱尺寸减低导致间接节省。在具体的实施方案中，本发明专利技术的方法用于纯化免疫球蛋白分子(例如，抗体)的过程中，所述过程缺少亲和纯化步骤，例如，蛋白A亲和层析纯化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用双级切线流超滤纯化多肽
本专利技术涉及使用双级切线流超滤(“TFF”)从含有目的分子的溶液分离该分子的方法。特别地，本专利技术的方法是涉及加工粗制进料流如条件化的细胞培养上清液以在后续(即，下游)提炼单元操作之前大幅度降低污染物水平和/或杂质水平。本专利技术的方法可以用于加工来自生物生产系统如发酵或其他细胞培养过程的粗制进料流，并且还可以消除在对高杂质负荷敏感的下游过程如层析单元操作之前对费时的杂质沉淀(例如，pH驱动型)过程和/或沉淀物过滤过程的需要。公开的双级TFF方法联合了可以在下述pH有利实施的至少两个TFF单元操作，所述pH对应于进料流(例如，细胞培养上清液)的pH或大约是该pH，一般是pH7.5±1.0。TFF单元操作补充、改善或替代纯化进料流的目的蛋白的传统过程的用途可以代表明显的直接和间接加工成本节省。例如，除了通过消除沉淀过程和沉淀物过滤过程而间接节约之外，通过双级TFF单元操作实现的杂质荷载降低可以通过改善下游柱性能，例如，层析分离、动态结合容量、运行寿命和/或所需的柱尺寸减低导致间接节省。在具体的实施方案中，本专利技术的方法用于纯化免疫球蛋白分子(例如，抗体)的过程中，所述过程缺少亲和纯化步骤，例如，蛋白A亲和层析纯化。
技术介绍
本专利技术涉及从含有目的分子、尤其生物分子(例如，蛋白质)的粗制溶液和/或生产溶液分离和/或纯化这些分子的方法。随着生物
进展，从粗产物溶液经济的加工大量生物分子已经变得日益有意义。特别地，生产和加工经济学可能在与开发和制造生物分子和/或药物(包括酶、抗体和其他特种蛋白质和肽)相关的的决策中发挥决定性作用。为了生产大部分的这类生物分子(例如，蛋白质、多肽、抗体)，重组DNA技术的使用已经变成可选择的生产方法。使用这类方法，可以在多种生物系统中表达大量的所需生物分子。这类系统包括基于细胞的系统(如细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞培养物(例如，具有目的蛋白的内源表达或转基因细胞培养物))、转基因动物和转基因植物。也已经缩减细胞培养系统或体内系统的生物分子途径至运行体外生产系统的基本组分。但是，采用这些生产生系统时，生物制药产业同时面临开发从粗生产溶液或生产材料回收所需生物分子(例如，蛋白质)的改进系统或新系统的同时挑战。粗生产溶液包括条件化细胞培养基、澄清匀浆/裂解的条件化细胞培养物、来自转基因动物的体液(例如，血清、乳和尿)和包含除所选择生物分子之外的起始物质及组分的体外生产溶液。回收方法必须不仅产生符合政府纯度和安全性标准的回收产物，还必须是经济上可行的。特别有利于从粗生产溶液分离生物分子的纯化方法一般包括基于亲和力的过程和/或单元操作。基于亲和力的层析以目的生物分子与固定至固态基质如基质或凝胶的结合部分特异性相互作用为基础分离生物分子。因此，目的生物分子变得与基质(一般含于柱内部)结合，同时进料流的污染物和其他不想要的组分穿过系统流过。随后从结合部分和/或柱洗脱并收集生物分子。因此，亲和层析柱是高度特异的并且可以产生非常纯的产物。就例如从细胞培养基纯化抗体而言，最经常用于亲和层析的结合部分是蛋白A。蛋白A亲和层析对抗体有高度选择性并且从输入样品如条件化细胞培养基开始，可以产生纯度大于95％的产物。尽管亲和层析是强有力捕获及纯化步骤，但是使用与所需生物分子结合的生物亲和部分(在本领域中还称作生物亲和配体)也与高加工成本相关。例如，生物亲和配体(正常情况下是生物分子本身)(例如，蛋白A)的成本是其他层析材料的7至15倍(参见，ProcessScalePurificationofAntibodies(JohnWiley&Sons,第1版,2009)，第5.3.1章)。另外，生物亲和配体易从基质和柱滤去。相对于使用例如滤膜的一种方法，这不仅显著地缩短柱的寿命，滤去的配体具有变性可能性并且可以引起目的分子的聚集物形成。另外，许多生物亲和配体如蛋白A是/将视为毒素，需要对产物流连续监测其存在。因此，生物亲和配体的使用不仅代表明显支出直接成本，如柱材料本身和增加替换方案成本，还代表明显支出与工艺维护、监测和可能的额外单元操作(例如，要求过滤沉淀物/聚集物和/或再加工)相关的间接成本。因此，生物亲和柱、它们的维护和它们的监测可以代表任何纯化方案中最明显的成本并且可能难以按成本有效的方式整合至产业运营中。考虑到与使用生物亲和配体相关的高成本，已经探索许多替代方案以补充或改善亲和层析方法，包括合成的亲和配体和混合模式树脂(参见，Gottschalk2009，第5.3.2章)。另外，也已经研究了完全消除亲和力单元操作的加工/纯化方法。这类方法包括过滤、离子交换层析、疏水性层析、凝胶过滤层析及其组合。例如，对纯化抗体的三步骤层析方法(不包括蛋白A层析)的系统评价已经由Follmann等人,J.Chromatog.1024(2004),79-85公开。一些研究最充分的用于补充或替换基于亲和力的处理法的生物分子纯化方法是包括离子交换层析方法的那些。特别地，已经在许多蛋白质纯化方案中研究与基于亲和力的单元操作联合和作为其替代的阳离子交换层析(“CEX”)(参见，例如，Arunakumari等人,Adv.ProcessChromatog.(Supp.BioPharmInt.)(2007),36-40；Arunakumari等人,BioPharm.Int.Supp.2009年3月2日；Wang等人,BioPharm.Int.Supp.March2,2008；Gottschalk2009,第5.3.3章；Cacciuttolo,PharmaceuticalProcessScale-Up(CRCPress,第2版(2006),第5章；Morrow,Gen.Eng.Biotech.News28(2008；仅可在线获得))。尽管其前景光明，但离子交换层析尚未完全替换亲和层析，但是已经适应于联合亲和层析在常见工业纯化过程中充当附加的纯化过程。然而，在层析过程中，载料(例如，引入加工/单元操作/柱中的产物流)的组成对柱的正常功能至关重要。因此，在具有层析加工/单元操作的纯化方法中，层析过程前载料的处理是必需的第一步骤。例如，在层析单元操作之前，通常必须将进料流(含有目的分子)调节至合适的pH，缓冲和电导率，取决于目的分子特定等电点和特定柱参数。因此，不仅特定层析过程，而且进料流组成均决定需要如何调整进料流。进料流的变动因此可能需要明显调整离子层析过程上游的单元操作和进料流加工。经常使用渗滤/切线流过滤(“TFF”)进行加工/进料流参数调整。在这个加工步骤期间，进料流溶剂在TFF期间通过渗滤逐渐与适用于特定层析操作的缓冲液交换。例如，就使用CEX纯化抗体而言，大部分过程在低电导率时CEX之前调节进料流至约5至7的pH，因为许多抗体显示大于7的等电点。然而，在进料流是条件化细胞培养基(例如，上清液或匀浆的细胞培养物)的情况下，在缓冲液交换期间调节进料流pH低于中性经常导致污染物如宿主细胞DNA(“HCDNA”)和宿主细胞蛋白(“HCP”)的沉淀(参见，例如，Gottschalk2009，第5.3.3章；Wang等人，2008)。沉淀事件具有明显的经济重要性，不仅因为它迫使增加至少另外一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用双级切线流超滤(TFF)从含有目的蛋白质的细胞培养液分离所述蛋白质的方法，其中所述双级TFF包括第一TFF单元操作和第二TFF单元操作，其中使用具有如此截留值的第一超滤膜，所述第一TFF单元操作过滤含有所述蛋白质的第一产物流，使得所述蛋白质回收于第一TFF单元操作的滞留物中；并且使用具有如此截留值的第二超滤膜，所述第二TFF单元操作过滤含有所述蛋白质的第二产物流，使得所述蛋白质回收于第二TFF单元操作的渗透物中；并且其中所述第一或所述第二产物流是细胞培养上清液。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.10.30 EP 12190682.01.一种使用双级切线流超滤(TFF)从含有目的蛋白质的细胞培养液分离所述蛋白质的方法，其中所述蛋白质具有至少10kD但是不大于500kD的分子量，其中所述双级TFF包括第一TFF单元操作和第二TFF单元操作，使用具有所述蛋白质分子量的一半(0.5倍)或更小的截留值的第一超滤膜，所述第一TFF单元操作过滤含有所述蛋白质的第一产物流，使得所述蛋白质回收于第一TFF单元操作的滞留物中；并且使用具有至少两倍(2倍)于所述蛋白质分子量但不大于1000kD的截留值的第二超滤膜，所述第二TFF单元操作过滤含有所述蛋白质的第二产物流，使得所述蛋白质回收于第二TFF单元操作的渗透物中；并且其中所述第一或所述第二产物流是细胞培养上清液。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一产物流是细胞培养上清液并且所述第一TFF单元操作在所述第二TFF单元操作的上游。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述双级TFF还包括第三TFF单元操作，使用具有如此截留值的第三超滤膜，所述第三TFF单元操作过滤含有所述蛋白质的第三产物流，从而所述蛋白质处于第三TFF单元操作的滞留物中，并且其中所述第三TFF单元操作在所述第一和第二TFF单元操作的下游。4.根据权利要求3所述的方法，其中第三超滤膜的截留值与第一超滤膜的截...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·贝克尔，S·纽曼，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH