本发明专利技术提供了美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3的分子量检测方法。采用高效空间排阻色谱法(HPSEC)对样品的分子量及其分布进行测定，以Superdex Peptide 10/300GL或TSK G2000PWXL为色谱柱；以水(含0.1%TFA)-乙腈(0-50:100-50V/V)、磷酸盐缓冲液(pH=5~8)、Tris-HCl缓冲液(pH=7~9)中的一种为流动相，流速0.5~0.7ml/min；检测波长为200nm~400nm；进样量为5-50μl；柱温为20℃~30℃。根据标准物质的线性回归方程可计算样品的分子量。本发明专利技术为研发以美洲大蠊为原料药材的新型抗肿瘤药物的安全性提供参考。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗肿瘤有效成分的分子量检测方法，特别涉及一种具有抗肿瘤作 用的美洲大蠊活性部位提取物的质量控制方法。
技术介绍
美洲大蠊)属昆虫纲，蜚蠊目，蜚蠊科，大蠊属，俗称幢 螂。其入药史记载早见于《神农本草经》，其谓"味咸寒，治血痰症坚，寒热，破积聚，喉咽痹， 内寒无子"。《本草纲目》中亦有记载，蜚蠊又名茶婆虫、香娘子，为本经中品，其主治"瘀血， 症坚，寒热，下气，利血脉"，常用于治疗小儿疳积、疔疮、喉蛾，无名肿毒、膨胀、梅毒以及毒 蛇、蜈蚣咬伤等疾病。 长期的科研探索发现，美洲大蠊具有广泛的药用价值和开发前景。大量研宄证实 了美洲大蠊具有抗肿瘤、抗病毒、促进组织修复、保肝、抗炎、镇痛等作用。目前，以美洲大 蠊为原料药材开发研制的药物有"康复新液"、"心脉隆注射液"、"肝龙胶囊"等，因其疗效显 著、副作用小等优点而广泛应用于临床。研宄发现，"康复新液"不仅对体表创伤的修复作用 显著，还可以治疗口腔溃疡、胃及十二指肠溃疡、溃疡性结肠炎等疾病。"心脉隆注射液"可 改善微循环、兴奋呼吸、利尿、增强心肌收缩力、增大体内脏器血液循环。"肝龙胶囊"为昆虫 类抗乙肝病毒（HBV)的国家二类中药新药。该药具有疏肝理脾、活血解毒的作用，在慢性乙 型肝炎的治疗方面效果显著，具有安全、有效、副作用小、给药方便等特点。 本专利技术研宄的具有抗肿瘤活性的美洲大蠊提取物C II -3由大理学院科研团队经 长期不懈的努力精心研制而成，其制备方法为：将新鲜或干燥的美洲大蠊虫体经醇水提取、 大孔吸附树脂柱层析、醇溶剂洗脱等工艺制得（中国专利：CN200810059054)。 大量文献报道了美洲大蠊提取物对肿瘤生长有显著的抑制作用。通过对美洲大蠊 提取物C II -3进行体外筛选，证明了该提取物对3株人肺癌细胞的生长均有一定的抑制作 用。何正春等人将美洲大蠊醇提物通过聚酰胺柱层析分离得到不同部 位后，采用MTT法对所得部位进行肿瘤细胞毒性测试，发现高活性部位的IC 5tl值接近阳性药 的三分之一，证明美洲大蠊醇提物中存在抑制肿瘤细胞生长的物质。文献报道美洲大蠊提取物高剂量C II -3可抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长，且 能降低小鼠血清中血管生长因子（VEGF)的含量，机制可能为减少VEGF的表达，进而发挥抑 制肿瘤生长的作用。 在中药现代化发展迅猛的时代，药物的质量问题应倍受重视。关于美洲大蠊药材、 提取物及其药物制剂的质量控制方法已有许多文献报道。本专利技术建立了美洲大蠊抗肿瘤活 性提取物C II -3的分子量检测方法，为开发研制以美洲大蠊为原料药材的新型抗肿瘤药物 的质量控制提供参考。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于研宄美洲大蠊抗肿瘤活性提取物C II -3的分子 量及其分布，设计该活性提取物的质量控制方法。 有关美洲大蠊抗肿瘤活性提取物C II -3的分子量检测方法尚未见文献报道，本发 明通过研宄，选用不同的分离柱进行分析，尝试了多种洗脱体系与色谱条件，最终建立了美 洲大蠊抗肿瘤活性提取物C II -3的分子量检测方法。 本专利技术采用HPSEC法，该方法包括以下步骤： (1)色谱条件与系统：以Superdex P印tide 10/300GL或TSK G2000PWa为色谱柱； 以水（含 0· 1%TFA)-乙腈（0-50:100-50V/V)、磷酸盐缓冲液（pH=5~8)、Tris-HCl 缓冲液 (pH=7~9)中的一种为流动相，流速0. 5~0. 7ml/min ;检测波长为200nm~400nm ;进样量为 5-50μ1 ;柱温为 20°C~30°C。 (2)标准物质溶液的配制：称取细胞色素 C、VB12、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘 肽、肌苷及酪氨酸适量，加水制成每1ml中各含0. lmg~2mg的溶液，分别过0. 22 μ m滤膜，作 为标准物质溶液。 (3)标准曲线的绘制：分别吸取上述标准物质溶液进行色谱分析，以标准物质出 峰的保留时间R t (min)为横坐标，其分子量的对数Log (Mr)为纵坐标，绘制标准曲线方程。 (4)供试品溶液的制备：称取美洲大蠊抗肿瘤活性提取物C II -3干粉20mg于IOml 量瓶中，加水，摇匀，定容至刻度。用0.22 ym滤膜过滤，即得。 (5)测定方法：吸取上述供试品溶液进行色谱分析，将样品出峰的保留时间代入 标准曲线方程，可求得各峰的相对分子质量，通过面积归一化法可计算出不同分子量范围 的相对百分比。 本专利技术所述的活性提取物C II -3的分子量检测方法，优选如下检测方法： (1)色谱条件与系统：以Superdex Peptide 10/300GL为色谱柱；以乙腈：水（含 0. 1%TFA)=25:75为流动相，流速0. 5ml/min ;检测波长为214nm ;进样量为20 yL ;柱温为 25。。。 (2)标准物质溶液的配制：称取细胞色素 C、氧化型谷胱甘肽、肌苷及酪氨酸适量， 加水制成每1ml中各含lmg、2mg、lmg、0. 5mg的单标溶液，吸取上述溶液各300 yL，混勾，过 0. 22 μ m滤膜，作为混合标准物质溶液。 (3)标准曲线的绘制：吸取上述混合标准物质溶液20 μ L进行色谱分析，以标准物 质出峰的保留时间Rt (min)为横坐标，其分子量的对数Log (Mr)为纵坐标，绘制曲线方程。 (4)供试品溶液的制备：称取美洲大蠊抗肿瘤活性提取物C II -3干粉20mg于IOml 量瓶中，加水，摇匀，定容至刻度。用0.22 ym滤膜过滤，即得。 (5)测定方法：吸取上述供试品溶液20yL进行色谱分析，将样品出峰的保留时间 代入标准曲线方程，可求得各峰的相对分子质量，通过面积归一化法可计算出不同分子量 范围的相对百分比。【具体实施方式】 下面结合【具体实施方式】对本专利技术作进一步说明。 美洲大蠊抗肿瘤活性提取物C II -3批号：20140608、20140828、20140829、 20140830、20140905、20140906、20140907、20141008、20141009、20141010。 以上提取物均为实验室自制，供下列实施例使用。 (1)检测波长的选择 本实验在214nm、254nm、265nm、280nm波长处观察样品出峰情况，结果显不，仅有214nm 处色谱图图形丰富，紫外吸收值明显。且肽键在214nm处有特征吸收峰，故选择214nm为检 测波长。 (2)流动相的选择 方法一、磷酸缓冲盐体系 体系a :0· 05mol · Γ1的磷酸盐缓冲液(含有0· Imol ·厂1NaCl，ρΗ=5· 8) 体系 b :0· 05mol · Γ1 的磷酸盐缓冲液(含有 0· Imol · L-1NaCl，ρΗ=7· 0) 体系 c :0· 05mol · Γ1 的磷酸盐缓冲液(含有 0· Imol · L4NaCl，ρΗ=7· 8) 方法二、Tris-HCl缓冲盐体系 体系 a :0· 05mol · T1Tris-HCl (含有 0· 3 mol · T1NaCl，ρΗ=7· 5) 体系 b :0· 05mol · T1Tris-HCl (含有 0· 3 mol · T1NaCl，ρΗ=8· 6) 方法三、有机本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ‑3的分子量检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤：(1)色谱条件与系统：以Superdex Peptide 10/300GL或TSK G2000PWXL为色谱柱，以水(含0.1%TFA)‑乙腈(0‑50:100‑50V/V)、磷酸盐缓冲液(pH=5~8)、Tris‑HCl缓冲液(pH=7~9)中的一种为流动相，流速0.5~0.7ml/min，检测波长为200nm~400nm，进样量为5‑50μl，柱温为20℃~30℃；(2)标准物质溶液的配制：称取细胞色素C、VB12、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、肌苷及酪氨酸适量，加水制成每1ml中各含0.1mg~2mg的溶液，分别过0.22μm滤膜，作为对照品溶液；(3)标准曲线的绘制：分别吸取上述标准物质溶液进行色谱分析，以标准物质出峰的保留时间Rt(min)为横坐标，其分子量的对数Log（Mr）为纵坐标，绘制标准曲线方程；(4)供试品溶液的制备：称取美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ‑3干粉20mg于10ml量瓶中，加水，摇匀，定容至刻度，用0.22μm滤膜过滤，即得；(5)测定方法：吸取上述供试品溶液进行色谱分析，将样品出峰的保留时间代入标准曲线方程，可求得各峰的相对分子质量，通过面积归一化法可计算出不同分子量范围的相对百分比。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖培云，杨永寿，那凯歌，刘光明，杨敏，
申请(专利权)人：大理学院，
类型：发明
国别省市：云南;53
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