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微流控-激光诱导荧光系统检测单个细胞中谷胱甘肽含量的方法技术方案

技术编号:11645040 阅读:332 留言:0更新日期:2015-06-25 04:16
本发明专利技术公开了一种用于单个细胞中谷胱甘肽含量检测的微流控-激光诱导荧光系统,及采用该系统快速、连续测定单个细胞内谷胱甘肽含量的方法,细胞经过2,3-萘二甲醛衍生化后,细胞内GSH与NDA生成的衍生物经激光照射会发射出荧光,样品的注入、分离、检测均在微流控芯片内进行,电驱动仪的四个电源输出端分别连接着微流控芯片的缓冲液池B、样品池S、废液池SW、缓冲废液池BW。微流控芯片置于激光诱导荧光系统的检测平台之上,衍生化后的细胞经过激光照射后发出的荧光被数据采集器采集,然后通过计算机软件进行显示。本发明专利技术的检测方法无需破膜操作即可对细胞内的GSH含量进行检测;减小了操作难度,缩短了操作时间,而且灵敏度和分辨率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及,属于生物检测

技术介绍
随着生命科学领域技术、设备的快速发展,对细胞的研宄也更加深入。细胞群体分析获得的统计平均结果,掩盖了细胞个体之间的差异,不能反映每个细胞的独立信息。而细胞是生物体结构和功能的基本单元,对细胞内的一些重要组分进行快速、灵敏地检测对于理解许多生理、病理过程以及疾病的早期诊断和治疗等具有重要意义。微流控芯片技术(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上,自动完成分析。近20年来,在Manz等提出的微全分析系统(Micro Total Analysis System, μ TAS)理念的引领下构建集成在几平方厘米芯片上的微流控分析系统,使得微流控芯片技术具有以下特点:散热快受到焦耳热的影响较小、液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等优点,可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析,可以在线实现样品的预处理及分析。这使得微流控芯片在生物科学、化学、医学、环境学等领域获得了巨大的发展潜力,已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研宄领域。目前的研宄常采用分析血清中某些蛋白质类标记物来辅助探寻病变,主要基于免疫化学的方法,一次只能分析一种标记物,操作繁琐耗时长。另外传统的分析细胞中标记物方法以大量细胞为前提,获取某一标记物含量的总值,并将该值与细胞数量的比值外推至单细胞内该标记物的含量。对于性质相对均一的细胞群来说,此方法可以接受,但在另外一些场合下,比如某些重大疾病的早期阶段,仅有个别细胞的组分发生变化,这时,传统方法将会平均掉该特异变化。因此,传统方法不适于病变的早期诊断。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸还有甘氨酸结合而成的三肽,会参与活性细胞许多生物过程。GSH是哺乳动物体内的重要保护因子,可以保护生物膜及生物大分子免受自由基的损伤。机体代谢产生的过多自由基会侵袭生命大分子,促进机体衰老,并诱发肿瘤或动脉硬化的产生。而谷胱甘肽可消除自由基,从而起到抗氧化、抗衰老的作用。谷胱甘肽不仅能消除人体自由基,还可以提高人体免疫力,预防很多炎症性的疾病。谷胱甘肽是诊断医学中对生物体与疾病相关性进行评价的重要靶标物质之一,白血病、子宫颈癌等多种疾病与细胞内的GSH的耗尽有关。癌症细胞系中GSH的含量通常比正常细胞中高。检测细胞内GSH含量对于很多疾病的早期预警和诊断具有重要意义。中国专利“微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞内物质的方法”(CN101672788A),采用微流控芯片化学发光法分析单个血红细胞中半胱氨酸、谷胱甘肽和血红蛋白的含量。但是该方法在检测单细胞中物质的时候需要进行细胞破膜处理才能对细胞内物质进行检测,而且检测装置采用的是组装光电倍增管的倒置显微镜,检测操作相对仍较为繁琐,检测的灵敏度仍有待进一步的提高。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的不足,本专利技术的目的是提供一种。以2,3-萘二甲醛(2,3-Naphthalenedicarboxaldehyde,NDA)作为衍生剂,可以透过细胞膜直接与细胞内的GSH发生反应,无需破膜操作即可对细胞内的GSH含量进行检测;细胞进样和分离过程使用液面差法和电驱动法相结合的方式,使多个细胞同时进入分离通道,通过控制细胞浓度即可实现短时间内同时对多个单细胞进行分离分析,减小了操作难度,缩短了操作时间。为实现上述目的,本专利技术采用下述技术方案:一种用于单个细胞中谷胱甘肽含量检测的微流控-激光诱导荧光系统,包括微流控芯片,所述微流控芯片为十字型微流控芯片,设置有缓冲液池B、样品池S、废液池SW和缓冲废液池BW四个储液池;所述微流控芯片的四个储液池分别与电驱动仪的四个电源输出端相连;所述微流控芯片置于激光诱导荧光系统的检测平台上,所述检测平台与用于采集微流控芯片上待检测细胞经激光照射后发出的荧光的数据采集器连接,数据采集器与计算机连接,数据信号通过计算机软件进行显示。所述微流控芯片的管道宽度为75um,深度为25um,缓冲液池B、样品池S、废液池SW至十字交叉点的距离均为5mm,缓冲废液池距十字交叉点距离为45mm。一种,步骤如下:(I)微流控芯片的预处理:依次使用氢氧化钠溶液(0.lmol/L)、超纯水和硼砂-硼酸缓冲溶液(pH = 9.2)对微流控芯片通道清洗1min ;(2)标准曲线的绘制:配制系列浓度梯度的还原型GSH溶液,与过量的NDA溶液衍生后待用;将微流控芯片固定于激光诱导荧光系统的平台上,向4个储液池内分别加入相同体积的硼砂-硼酸缓冲液,PH = 9.2,将电驱动仪的4个电极分别固定于4个储液池内,向4个电极施加电压,使4个储液池的电压满足:VB>VS= V Sff?VBff,缓冲液由缓冲液池B向缓冲废液池BW流动,进行荧光图谱的基线平衡;基线平衡后,关闭电驱动仪,吸出样品池S中的缓冲液,加入衍生后的GSH溶液,然后打开电驱动仪,向4个电极施加进样电压VS>VB =VBff?VSff,使样品池S内的GSH溶液向废液池SW流动,待GSH流到十字交叉口处时,将电压调整为分离电压,使VB>VS= V Sff?VBff, GSH溶液即从十字交叉口处流向缓冲废液池BW,经过检测器处激光照射后发射出荧光,经数据采集器采集后于计算机软件上显示出其荧光图谱;由相同方法得到系列浓度梯度的GSH衍生溶液的荧光图谱,根据图谱中荧光峰峰高值得到GSH的标准曲线;(3)单个细胞内GSH含量的检测:将待检测细胞经清洗稀释后,与NDA反应15min待用;将微流控芯片固定于激光诱导荧光系统的平台上,进行荧光图谱的基线平衡,待基线平衡后进样,细胞进样过程中采用液面差法,当细胞流到十字交叉口处后,向4个储液池施加分离电压VB>VS= V Sff?VBff,细胞即在电渗流的作用下由十字交叉口处流向缓冲废液池BW,经过检测器处激光照射后发射出荧光,然后由数据采集器采集后于计算机软件上显示出其荧光图谱,根据荧光谱图中荧光峰的峰高与GSH标准曲线进行代入计算即可获得每个细胞内GSH的含量。步骤(3)中,荧光图谱基线平衡的方法为:将微流控芯片固定于激光诱导荧光系统的平台上,向4个储液池内分别加入相同体积的硼砂-硼酸缓冲液,将电驱动仪的4个电极分别固定于4个储液池内,向4个电极施加电压,使4个储液池的电压满足:VB>VS =VSff?VBff,缓冲液由缓冲液池B向缓冲废液池BW流动,进行荧光图谱的基线平衡。步骤(3)中,液面差法进样的具体操作为:吸出样品池S和废液池SW中的缓冲液后,向样品池S中加入12 μ L衍生后的细胞悬液,使4个储液池内液面高度变为Hs>Hb =Hbw?Hsw,样品池S内的细胞即在重力作用下流向废液池SW。步骤(2)中,进样电压的具体设置为Vs= 350V,Vb= 180V,Vbw= 180V, Vsff= 0V,电压施加时间为25s ;分离电压的具体设置为Vb= 1800V,Vs= 1300V, Vsff= 1300V, Vbw= 0V,电压施加时间为150s。步骤(3)中,分离电压的具体设置为Vb= 1800V, Vs= 1300V,本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种用于单个细胞中谷胱甘肽含量检测的微流控‑激光诱导荧光系统,其特征在于,包括微流控芯片,所述微流控芯片为十字型微流控芯片,设置有缓冲液池B、样品池S、废液池SW和缓冲废液池BW四个储液池;所述微流控芯片的四个储液池分别与电驱动仪的四个电源输出端相连;所述微流控芯片置于激光诱导荧光系统的检测平台上,所述检测平台与用于采集微流控芯片上待检测细胞经激光照射后发出的荧光的数据采集器连接,数据采集器与计算机连接。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:刘汝涛郝明路
申请(专利权)人:山东大学
类型:发明
国别省市:山东;37

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