基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途制造技术

技术编号:11638232 阅读:242 留言:0更新日期:2015-06-24 13:09
本发明专利技术提供了一种基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途,其结构式如式VI所示:其中,荧光素选自BODIPY、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、Alexa、Squaring染料、产生能量转移染料的组合以及其衍生物中的一种;R1、R2、R3、R4、R6为各种取代基,R5为除-C2H5以外的取代基、且R1、R2、R3、R4、R5、R6不同时为H;n为0~10的整数。与现有技术相比,本发明专利技术合成了一类新的基于偶氮连接单元的可逆终端;该类可逆终端在温和的条件下可以实现高效率的剪切,可用于DNA测序;同时,其合成所需原料简单易得,合成过程均为常规化学反应,可用于大规模推广使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于DNA测序
,具体设及一种基于偶氮连接单元的巧光标记核巧 酸及其用途。
技术介绍
DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后,DNA 测序技术得到了迅速发展。DNA测序值NA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序 列,也就是腺嚷岭(A)、胸腺喀晚订)、胞喀晚(C)与鸟嚷岭佑)的排列方式。发展精确、高 通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。 合成法测序(Sequencing By Synthesis, SB巧是新一代DNA测序技术之一。合成 法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定,并在固定的DNA测序模板上杂交结 合通用的DNA引物,分别控制4种核巧酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或 延伸核巧酸,实现高通量并行的DNA序列信息的检测。 在合成法测序中,首先要合成DNA链延长的四种核巧酸原料,即"可逆终 端"(reversible terminator)。该类核巧酸除了要求3 哲基阻断外,为了不影响下一 个标记核巧酸的并入和识别,还要求通过一个可剪切的连接单元把核巧酸和巧光素连接起 来。然后,在下一个标记核巧酸并入之前,在温和条件下使该连接单元断裂,实现DNA链的 延伸,从而读出DNA碱基序列。该连接单元的性能对DNA测序的读长和效率有至关重要的 影响。因此,人们一直致力于发展新的可剪切连接单元,W提高DNA测序的效率。目前已有 文献报道的连接单元有还原敏感型(二硫键和偶氮化合物);光敏感(邻硝基苄基醇,苯 甲酯甲基醋衍生物及其它连接单元);亲电子试剂/酸敏感型;金属剪切型W及氧化剂敏感 等。 而现有的可剪切连接单元存在剪切条件不够温和、效率不高,用于测序时读长太 短等诸多缺点。因此,设计、合成新的可剪切连接单元,并探索合适的剪切条件对提高测序 效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。偶氮化合物在偶氮还原酶或者连二亚硫酸钢 等还原剂作用下可W实现快速、完全剪切,相比酸敏感连接单元,还原剂对DNA链没有任何 损伤,在具体的实验过程中,只需要通过调节还原剂的用量即可很方便地调节剪切速度。目 前关于偶氮化合物作为连接单元应用于DNA测序的报道很少,所W设计、合成基于偶氮连 接单元的可逆终端并用于DNA测序具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供基于偶氮连接单元可逆终端的合成及其在DNA测序中的 用途。本专利技术设计合成的一类新的基于偶氮连接单元的可逆终端,该类化合物合成原料简 单易得,合成过程均为常规化学反应,易于实现大量合成;该类化合物可与核巧酸和巧光素 实现高效率的连接。通过研究该类化合物的裂解性能,发现该类化合物在温和的条件下可 W实现高效率的裂解,具有应用于DNA测序的巨大潜力。所W,基于偶氮结构的可逆终端在 DM测序体系中能够提高测序效率。 本专利技术是通过W下技术方案实现的: 第一方面,本专利技术提供了一种基于偶氮连接单元的巧光标记核巧酸,其结构式如 式VI所示:【主权项】1. 一种基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸,其结构式如式VI所示:其中,荧光素选自BODIPY、罗丹明、香豆素、咕吨、花青、芘、酞菁、Alexa、Squaring染 料、产生能量转移染料的组合以及其衍生物中的一种;Rp R2、R3、R4、&为各种取代基,R 5为 除-C2H5以外的取代基、且R n R2、R3、R4、R5、&不同时为H ;n为O~10的整数。2. 如权利要求1所述的基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸,其特征在于,所述R i 为-H,馬为-H、-COOH 或-COOMe,R 3为-H,R 4为-OH,R 5为-H,R 6为-H 或-OH。3. 如权利要求1所述的基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸,其特征在于,其结构如 式VII、式VIII或式IX所示:4. 一种如权利要求1所述的基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸的制备方法,其特征 在于,所述制备方法包括如下步骤: 将偶氮连接单TII中的氨基与荧光 素的羧基在缩合剂作用下发生缩合反应形成酰胺化合物荧光 素 -I沂述荧光素-I中的叠氮基与 ,中的炔基发生点击反应,即得所述基于偶氮连 接单元的荧光标记核苷酸。5. -种如权利要求1所述的基于偶氮连接单元的焚光标记核苷酸中的偶氮连接单元, 其结构式如式I所示:其中,札、R2、R3、R4、R6为各种吸电子或供电子的烷基或芳基取代基,R 5为除-C 2H5以外 的取代基、且札、R2、R3、R4、R5、R 6不同时为-H ;n为O~10的整数。6. 如权利要求5所述的偶氮连接单元,其特征在于,包括式(II)、式(III)、式(IV)或 式(V)中的任意一种结构: 当所述L R2、R3、R5均为-H,R 4和R 6均为-OH时,结构如式(II)所示:当所述Rn R2、R3、R5、R6均为-H,R 4为-OH,结构如式(III)所示:当所述Rp R3、R5、R6均为-H,R 2为-C00H,R 4为-OH,结构如式(IV)所示:当所述R3、R5、R6均为-H,R 2为-COOMe,R 4为-OH,结构如式(IV)所示:7. -种如权利要求5所述的偶氮连接单元的制备方法,其特征在于,所述制备方法包 括如下步骤: 将化合物. 在浓盐酸和亚硝酸钠的作用下进行重氮化反应后,与化 合物B£氢氧化钠、乙醇和水的混合溶液反应得到化合物将化合物C在三氟乙酸中 脱保护基,得到目标产物I。8. -种如权利要求1~4中任意一项所述的基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸在 DNA测序中的用途。【专利摘要】本专利技术提供了一种基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途,其结构式如式VI所示:其中,荧光素选自BODIPY、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、Alexa、Squaring染料、产生能量转移染料的组合以及其衍生物中的一种;R1、R2、R3、R4、R6为各种取代基,R5为除-C2H5以外的取代基、且R1、R2、R3、R4、R5、R6不同时为H;n为0~10的整数。与现有技术相比,本专利技术合成了一类新的基于偶氮连接单元的可逆终端;该类可逆终端在温和的条件下可以实现高效率的剪切,可用于DNA测序;同时,其合成所需原料简单易得,合成过程均为常规化学反应,可用于大规模推广使用。【IPC分类】C12Q1-68, C07H19-10, C07H1-00【公开号】CN104725453【申请号】CN201510031230【专利技术人】沈玉梅, 杨晴来, 谭连江, 李鑫辉, 邵志峰, 龚兵, 李小卫, 刘亚智, 张震 【申请人】上海交通大学【公开日】2015年6月24日【申请日】2015年1月21日本文档来自技高网
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基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途

【技术保护点】
一种基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸,其结构式如式VI所示:其中,荧光素选自BODIPY、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、Alexa、Squaring染料、产生能量转移染料的组合以及其衍生物中的一种;R1、R2、R3、R4、R6为各种取代基,R5为除‑C2H5以外的取代基、且R1、R2、R3、R4、R5、R6不同时为H;n为0~10的整数。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:沈玉梅杨晴来谭连江李鑫辉邵志峰龚兵李小卫刘亚智张震
申请(专利权)人:上海交通大学
类型:发明
国别省市:上海;31

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