一种中性蛋白酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种中性蛋白酶及其应用。本发明专利技术构建的里氏木霉工程菌能高效重组表达中性蛋白酶，发酵酶活达到5000U/mL。本发明专利技术所述中性蛋白酶的最适pH为7.0，且在pH50-8.0时能保持85%以上的酶活性；最适温度为65℃，且在55-70℃时能保持85%以上的酶活性。所述中性蛋白酶可广泛应用于食品和皮革加工领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及。
技术介绍
蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶，后者为羧基肽酶。按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反应的最适PH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。蛋白酶广泛存在于动物内遭、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗，还可用于将组织处理成为单个细胞，进行细胞组织培养。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血溃和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。目前对于中性蛋白酶的研究还很少，主要在涉及生产高级调味品和食品营养强化齐U，以及皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶等加工领域。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术通过将米曲霉(.Aspergillus orjzae)的中性蛋白酶基因转入里氏木霉reesei )中，构建得到里氏木霉工程菌株，能高效分泌表达中性蛋白酶。所述中性蛋白酶能广泛应用于皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶等加工领域。本专利技术一方面提供了一种中性蛋白酶，其特征在于: Ca)其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的中性蛋白酶； (b)在(a)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有中性蛋白酶活性的酶。用于编码上述中性蛋白酶的基因，其中一种编码核苷酸序列为SEQ ID N0:2。本专利技术另一方面涉及上述中性蛋白酶的应用。本专利技术的里氏木霉工程菌能高效重组表达中性蛋白酶，发酵酶活达到5000U/mL。本专利技术所述中性蛋白酶的最适作用pH为7.0，且在pH50-8.0时能保持60%以上的酶活性；最适作用温度为65°C，且在55-70°C时能保持85%以上的酶活性。所述中性蛋白酶可广泛应用于食品和皮革加工领域。其中，利用所述中性蛋白酶水解猪皮中的胶原蛋白，水解率高达68%，效率高，污染少，应用效果好。【附图说明】图1为本专利技术所述中性蛋白酶作用pH-相对酶活曲线。图2为本专利技术所述中性蛋白酶作用温度-相对酶活曲线。【具体实施方式】本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR B1LOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本专利技术限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本专利技术所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICT1NARY OF MICROB1LOGY AND MOLECULARB1LOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和 COLLINS DICT1NARY B1LOGY (Hale etal.，2003)为技术人员提供了本专利技术中所使用的许多术语的一般性解释。除非另作说明，核酸是按5,至3,方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母代码。如本文所用，术语“基因”指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。术语“核酸”包括DNA、RNA,单链或双链的，以及它们的化学修饰物。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。术语“载体”指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。术语“表达载体”表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。术语“启动子”表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸，本专利技术包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本专利技术的编码脂肪酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。下面结合具体实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1蛋白酶基因的克隆 以米曲霉(Aspergillus orjzae)基因组总DNA为模板,利用上下游引物进行扩增。PCR扩增条件为 95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30 个循环；72°C 7min。凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，将扩增产物送北京华大基因进行测序分析。结果显示，回收得到的扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。将上述序列通过NCBI Blast比对分析发现，SEQ ID NO:1与米曲霉的蛋白酶氨基酸序列相似性最高当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中性蛋白酶，其特征在于，（a）其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的中性蛋白酶；（b）在（a）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有中性蛋白酶活性的酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李佩佩，齐建，王华明，黄亦钧，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37