荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法技术

荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法。本发明专利技术涉及荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法。 （I）

【技术实现步骤摘要】
荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法
本专利技术涉及荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法。
技术介绍
荧光染料修饰的核苷酸及类似物广泛应用于生物分析，DNA序列分析和临床诊断等领域。荧光染料修饰的核苷酸及类似物一般在水中溶解度高，极性大。液相合成的方法一般操作繁琐，分离比较困难，分离纯化需要结合反相色谱和离子色谱去除反应体系中残余的游离的荧光染料和核苷酸，难以大量生产。美国化学家Merrifield(Merrifeld,R.B.J.Am.Chem.Soc.1963,85,2149.)在1963年首先用树脂负载法合成了四肽化合物以来,固相有机合成已经从最初的肽合成扩展到各类有机小分子，复杂天然产物的合成和DNA合成等领域。固相合成的特点是简化了多步骤的合成，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化。使用过量反应物，使目标反应完全，使最终产物得到较高的产率。本专利技术的目的在于提供荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，解决荧光染料修饰的核苷酸及类似物液相合成分离困难导致难以大量生产的技术问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种制备式(1)荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，其中取代基具有以下的含义：M是H,Na或KR1为H或OHR2为H或OHR3为C1-C8直链烷基(CH2)nBase为具有下列结构的碱基或碱基类似物取代基：Dye为具有下列结构的荧光染料取代基团：其中取代基具有以下的含义：R4为OH,NH2，N(Me)2或N(Et)2,N(Pr)2R5为O,或NH2+,N(Me)2+或N(Et)2+,N(Pr)2+R6为H,F,Cl，Br或IR7和R8为H或CH2NH2，或者具有以下结构的取代基：R9为H，CH3或CH2CH3其特征是包括以下步骤：a.将式(II)化合物用DMF溶解,再加入氢氧化钠和树脂，搅拌均匀，振荡反应；再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤后，得到式(III)化合物b.将式(IV)化合物其中FMOC为芴甲氧羰基与式(III)化合物碘化铜以及无水DMF混合，在氦气保护下,注入无水三乙胺，反应10-20min后,在惰性气体的保护下，迅速投入四(三苯基膦)钯,反应结束后再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤后，再加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基，得到式(V)化合物c.将式(VI)化合物R10和R11为H或芴甲氧羰基氨基甲基，或者具有以下结构的取代基：与式(V)混合，加入羟基苯并三唑，N,N'-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，经酰胺化反应后，再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤，获得式(VII)化合物；R10和R11为芴甲氧羰基氨基甲基时，树脂洗涤后加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基后获得式(VII)化合物d.在所得的式(VII)化合物中加入盐酸，振荡后过滤，取滤液洗涤后冻干得到式(I)化合物。步骤a中的树脂为Merrifield树脂或者王树脂；式(II)化合物与树脂混合时，式(II)化合物与树脂的摩尔比是1.5-3；步骤a中在90-130℃下反应的时间为3-6小时；步骤b和c中六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液浓度为15-40％(v/v)；步骤c中酰胺化反应，羟基苯并三唑与式(VI)化合物的摩尔比为0.05-0.2，N,N'-二异丙基碳二亚胺与式(VI)化合物的摩尔比为0.05-0.2，4-二甲氨基吡啶与式(VI)化合物的摩尔比为0.05-0.2；步骤a,b和c中，反应结束后洗涤树脂的溶剂为N,N’-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，醋酸水溶液和甲醇，醋酸水溶液的浓度为5-10％(w/v)；步骤d中在室温下用盐酸使式(I)化合物从树脂上脱离下来，盐酸与式(VII)化合物的摩尔比为1.5-4.5，洗涤所用的洗涤液为乙酸乙酯。具体实施方式本实施例中一些缩写具有以下含义：MR：Merrifield树脂DMF：N,N'-二甲基甲酰胺5-IDUTP：5-碘代-2'-脱氧尿嘧啶核苷三磷酸四钠盐MR-5-IDUTP:5-碘代-2'-脱氧尿嘧啶核苷三磷酸树脂FMOC-NPY：芴甲氧羰酰基胺基-1-戊炔MR-NPYDUTP:5-胺基-1-戊炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷三磷酸树脂HOBt:羟基苯并三唑DIC:N,N'-二异丙基碳二亚胺DMAP:4-二甲氨基吡啶FMOC-CAMF：二芴甲氧羰酰基-5-羧基-5’-氨基甲基荧光素MR-NPYDUTP-CAMF:5-羧基-5’-氨基甲基荧光素修饰的1-戊炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷三磷酸树脂NPYDUTP-CAMF:5-羧基-5’-氨基甲基荧光素修饰的1-戊炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷三磷酸实施例11.将5-IDUTP6.66g(10mmol)分散到100mLDMF中,加入NaOH0.60g(15mmol),室温搅拌2h,加入Merrifield树脂6.25g(5mmol),90℃下反应6h,分别用40mLDMF,40mLCH2Cl2,40mL5％醋酸水溶液和40mL甲醇洗涤,真空干燥得MR-5-IDUTP9.1g。2.将MR-5-IDUTP(9.1g,4.8mmol),FMOC-NP(2.2g,7.2mmol),碘化铜(0.19g,1mmol)投入到100mL单口烧瓶中,加无水DMF100mL.氮气保护下,注人无水三乙胺(1.7mL,12mmol),反应10min后,迅速投入四(三苯基膦)钯(0.46g,4mmol),反应烧瓶用锡箔纸包裹。室温反应20小时后，分别用40mLDMF,40mLCH2Cl2,40mL5％醋酸水溶液和40mLCH3OH洗涤；然后再加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基后获得真空干燥得MR-NPYDUTP7.8g。3.将MR-NPYDUTP(7.8g,4.2mmol)溶于100mLDMF中，再加入FMOC-CAMF(3.15g，5mmol),搅拌均匀后加入羟基苯并三唑N,N'-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶各0.6g,通氮气室温下反应2小时，分别用40mLDMF,40mLCH2Cl2,40mL5％醋酸水溶液和40mLCH3OH洗涤；然后再加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基后获得MR-NPYDUTP-CAMF8.5g。将MR-NPYDUTP-CAMF放入烧瓶中，加入盐酸60mL(1mol/L)振荡12小时后过滤，取滤液用3倍体积的乙酸乙酯洗涤后冻干得到NPYDUTP-CAMF3.3g。本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备式（I）荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，（I）其中取代基具有以下的含义：M是H, Na或KR1为H或OHR2为H或OHR3为C1‑C8直链烷基(CH2)nBase为具有下列结构的碱基或碱基类似物取代基：Dye为具有下列结构的荧光染料取代基团：其中取代基具有以下的含义：R4为OH, NH2， N（Me）2或N（Et）2, N（Pr）2R5为O,或NH2+, N（Me）2+或N（Et）2+, N（Pr）2+R6为H, F, Cl，Br或IR7和R8为H或CH2NH2，或者具有以下结构的取代基：R9为H，CH3或CH2CH3其特征是包括以下步骤：a．将式（II）化合物（II）Base为具有下列结构的碱基或碱基类似物取代基：用DMF溶解,再加入氢氧化钠和树脂，搅拌均匀，振荡反应；再分别用N,N’‑二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤后，得到式（III）化合物（III）；b．将式（IV）化合物(IV)其中FMOC为芴甲氧羰基与式（III）化合物,碘化铜以及无水DMF混合，在氮气保护下, 注入无水三乙胺，在氮气的保护下，投入四(三苯基膦)钯, 反应结束后，再分别用N,N’‑二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤后，再加入六氢吡啶的N,N’‑二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基，得到式（V）化合物（V）；c．将式（VI）化合物（VI）R10和R11为H或芴甲氧羰基氨基甲基，或者具有以下结构的取代基：与式（V）混合于N,N’‑二甲基甲酰胺中，加入羟基苯并三唑， N,N'‑二异丙基碳二亚胺和DMAP4‑二甲氨基吡啶，经酰胺化反应后，再分别用N,N’‑二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤，获得式(VII)化合物；R10和R11为芴甲氧羰基氨基甲基时，树脂洗涤后加入六氢吡啶的N,N’‑二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基后获得式(VII)化合物然后加入六氢吡啶的N,N’‑二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基后获得式(VII)化合物（VII）；d． 在所得的式(VII)化合物中加入盐酸，振荡后过滤，取滤液洗涤后冻干得到式(I)化合物。...

【技术特征摘要】
1.制备式(I)荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，其中取代基具有以下的含义：M是H,Na或KR1为H或OHR2为H或OHR3为C1-C8直链烷基(CH2)nBase为具有下列结构的碱基或碱基类似物取代基：Dye为具有下列结构的荧光染料取代基团：其中取代基具有以下的含义：R4为OH,NH2,N(Me)2或N(Et)2,N(Pr)2R5为O,或NH2+,N(Me)2+或N(Et)2+,N(Pr)2+R6为H,F,Cl,Br或IR7和R8为H或CH2NH2，或者具有以下结构的取代基：R9为H,CH3或CH2CH3其特征是包括以下步骤：a.将式(II)化合物Base为具有下列结构的碱基或碱基类似物取代基：用DMF溶解，再加入氢氧化钠和树脂，搅拌均匀，振荡反应；再分别用N,N’-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，醋酸水溶液和甲醇洗涤后，得到式(III)化合物步骤a中所述树脂为Merrifield树脂；b.将式(IV)化合物其中FMOC为芴甲氧羰基与式(III)化合物，碘化铜以及无水DMF混合，在氦气保护下，注入无水三乙胺，投入四(三苯基膦)钯，反应结束后，再分别用N,N’-二甲基甲酰胺，二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤后，再加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基，得到式(V)化合物c.将式(VI)化合物R10和R11为H或芴甲氧羰基氨基甲基，或者具有以下结构的取代基：与式(V)混合于N,N’-二甲基甲酰胺中，加入羟基苯并三唑，N,N'-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，经酰胺化反应后，再分别用N,...

【专利技术属性】
技术研发人员：马东杰，张伟，
申请(专利权)人：上海毕欧桥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31