一种细胞因子颗粒及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种细胞因子颗粒及其应用，其包括细胞因子颗粒制作方法，所述的颗粒包含一个或多个细胞因子以及重组蛋白gag形成的颗粒；以及细胞因子颗粒体外刺激单个核细胞分化的方法，其中包括细胞因子颗粒体外刺激单个核细胞分化为NK细胞或T细胞并扩增其数量。细胞因子颗粒比细胞因子刺激作用更强，效果显著。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞因子颗粒及其应用
本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及利用生物工程技术制备的细胞因子颗粒及其在体外刺激单核细胞分化与扩增的应用。
技术介绍
免疫细胞治疗技术的发展使免疫科学的应用发生重大变化，其针对肿瘤的疗效正在改变肿瘤患者的生存期和生存质量。例如，自体免疫细胞疗法，通过从肿瘤患者外周血中分离出单个核细胞，使用含有针对性的刺激因子的培养液，刺激淋巴细胞的增殖和分化，使其数量增多并具备抗瘤特异性，然后回输到肿瘤患者体内，对肿瘤有明显的治疗效果。这些应用的免疫细胞包括：LAK细胞，TIL细胞，CIK细胞，T细胞，NK细胞，DC细胞，DC-CIK细胞等。体外淋巴细胞分化和扩增的效率取决于刺激因子，其中以细胞因子为主。对于一定数量的单个核细胞，不同的刺激方法和不同的细胞因子会使刺激效率造成较大差异，差异包括淋巴细胞增殖所需要的时间，细胞状态和活力。一般地，使用常规细胞因子蛋白刺激单个核细胞，因为细胞因子蛋白通常是小分子蛋白，对细胞的刺激作用较缓慢，而细胞增殖缓慢，会导致所获得的细胞总量中老化细胞所占的比例升高，从而影响整体细胞的状态和活力。因此，使细胞较快速度增殖，提高细胞整体状态的一致性，是保证整体细胞状态和活力的有效办法。
技术实现思路
针对现有技术的细胞因子蛋白单独作用效果较弱的不足，本申请进行了研究，寻求一种改善的刺激单个核细胞分化与扩增的方法，及其中利用的细胞因子颗粒。为解决上述技术问题，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供一种细胞因子颗粒，其中，所述颗粒包括细胞因子和gag蛋白。优选的，所述颗粒的表面负载或展示所述细胞因子。优选的，所述颗粒通过细胞分泌的方式形成。优选的，所述颗粒还包括共刺激分子。更优选的，所述共刺激分子为CD137L。优选的，所述的细胞因子，可以是一个或者多个。优选的，所述的细胞因子，包括但不限于白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和/或趋化性细胞因子。更优选的，所述细胞因子是白细胞介素。本专利技术还提供一种表达载体系统，其中所述表达载体系统包括(1)包含重组蛋白gag基因序列的载体和(2)包含细胞因子基因序列的载体。优选的，所述表达载体系统还包括共刺激分子基因。更优选的，所述共刺激分子为CD137L。优选的，所述载体是质粒。更优选的，所述质粒为真核表达载体pCMV。优选的，所述的细胞因子，可以是一个或者多个。优选的，所述的细胞因子，包括但不限于白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和趋化性细胞因子。更优选的，所述细胞因子是白细胞介素。本专利技术还提供一种宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含上述表达载体系统。优选的，所述宿主细胞表达细胞因子和gag蛋白，通过细胞分泌形成包含细胞因子和gag蛋白的颗粒。更优选的，所述颗粒还包含共刺激分子。更优选的，所述共刺激分子为CD137L。优选的，所述的宿主细胞选自293T，293，A549等。优选的，将所述表达载体系统导入宿主细胞中。优选的，所述的导入方法，包括但不限于磷酸钙转染，脂质体转染，阳离子转染、电穿孔转染，病毒载体导入，显微注射。本专利技术还提供一种上述细胞因子颗粒的制备方法。优选的，所述制备方法，包括将上述的宿主细胞在合适的条件下表达，通过细胞分泌形成颗粒。优选的，颗粒上的表面可以负载和展示一种或多种细胞因子。优选的，所述的gag基因序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供一种上述细胞因子颗粒在制备刺激单个核细胞分化和扩增试剂中的应用。本专利技术还提供一种上述细胞因子颗粒在刺激单个核细胞分化和扩增中的应用。优选的，所述应用在体外进行。更优选的，所述应用不是治疗方法。本专利技术还提供一种刺激单个核细胞分化和扩增的方法，将上述细胞因子颗粒体外对单个核细胞进行刺激。优选的，所述方法不是治疗方法。优选的，根据不同的细胞因子组合可用于刺激单个核细胞分化成不同的免疫细胞类型，其中包括NK细胞和/或T细胞。本专利技术通过颗粒作为细胞因子的载体，能够改善细胞因子对单个核细胞的刺激效果，提高细胞因子的刺激效率。明显提高单个核细胞分化和扩增NK细胞或T细胞的数量，同时，NK细胞或T细胞分泌的细胞因子的数量和靶细胞杀伤率显著提高。一方面，本专利技术的细胞因子颗粒可以用于刺激单个核细胞分化和扩增，另一方面，根据分化的免疫细胞类型不同，而分泌不同的具有更强活性的细胞因子，即可以用于制备细胞因子，例如细胞因子颗粒刺激单个核细胞分化和扩增NK细胞或T细胞，随后NK细胞或T细胞分泌干扰素和肿瘤坏死因子，即本专利技术的细胞因子颗粒也可用于制备干扰素和肿瘤坏死因子等细胞因子。并进一步应用于临床或者研究。附图说明图1制备质粒示意图图2实施例3中PBMC增殖细胞计数图3实施例3中NK细胞杀伤活性图4实施例4中PBMC增殖细胞计数图5实施例4中NK细胞杀伤活性图6实施例5中PBMC增殖细胞计数图7实施例5中T细胞杀伤活性具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术所述技术方案作进一步的说明。实施例1：表达载体系统制备1、重组蛋白gag质粒的制备(1)核酸提取获得gag基因的RNA：使用QIAGEN公司QIAampUltrasensvirus试剂盒对鼠白血病病毒MLV的核酸进行提取。具体方法：取1ml病毒样品至2mlEP管并平衡温度至15℃-25℃，加800μlBufferAC，加5.6μlcarrierRNA到EP管盖子里，然后漩涡振荡10s混匀；室温培育10分钟，3200rpm离心3分钟，弃去全部上清；加300μlBufferAR(60℃预热)加20μl蛋白酶K，漩涡振荡使沉淀全部溶解；40℃水浴10分钟期间漩涡振荡一次5秒钟，将其全部移入QIAampSpinColumn6000rpm离心1分钟弃去废液；加500μlBufferAW17500rpm离心1分钟弃去废液，加500μlBufferAW215000rpm离心3分钟弃去废液，加30μlBufferAVE7500rpm离心1分钟，收集含RNA洗脱液，-20℃保存。(2)逆转录RNA为cDNA:用Invitrogen逆转录试剂盒(SuperScriptII)对抽提的病毒RNA进行逆转录具体方法：取1.5ml离心管，加去离子水5μl、随机引物(10uM)1μl、样品RNA5μl、dNTPmix(10mM)1μl，65℃孵育5分钟后置于冰上，加5×First-strandBuffer4μl、0.1M、DTT2μl、RNaseOUT1μl，25℃孵育2分钟，加SuperScriptTMIIRT1μl，25℃孵育10分钟，42℃孵育50分钟，70℃孵育15分钟，取2μl逆转录产物进行PCR扩增。(3)扩增cDNA中的gag基因的PCR产物：分别使用F-primer:TCACCGTCGTCGACGAATTCGCCACCATGGGCCAGGCTGTTACCAC(SEQIDNO.3)R-primer:GCCTGGTCTAGAGCGGCCGCTCATTACTCATCTTCTATGTTTAGGGTCAGC(SEQIDNO.4)两对引物，PCR扩增gag片段。PCR反应体系：10×HighFidelityPCRBuffer5μl；10mMdNTPmixture1μl；50mMMgSO42μl；Primer1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞因子颗粒，其特征在于：所述颗粒包括细胞因子和gag蛋白，优选的，所述颗粒的表面负载或展示所述细胞因子。

【技术特征摘要】
1.一种细胞因子颗粒，其特征在于：所述颗粒包括细胞因子和gag蛋白，其特征在于，所述颗粒通过细胞分泌的方式形成，颗粒的表面负载或展示所述细胞因子，所述细胞因子选自白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和/或趋化性细胞因子；所述细胞因子氨基酸序列的N端融合信号肽，C端融合膜定位信号；所述颗粒还包括共刺激分子CD137L。2.如权利要求1所述的颗粒，所述细胞因子是白细胞介素。3.如权利要求1-2任一所述的颗粒，所述细胞因子与CD137L使用2A肽链连接。4.一种可以通过细胞分泌的方式表达权利要求1-3任意一项所述细胞因子颗粒的表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永辉，林小靖，
申请(专利权)人：张永辉，林小靖，
类型：发明
国别省市：河南;41