一种重组大肠杆菌高密度培养生产四氢嘧啶的方法技术

本发明专利技术提供了一种重组大肠杆菌高密度培养生产四氢嘧啶的方法，所述方法包括利用大肠埃希氏菌Escherichia coli BW-pBAD-ectABC，保藏编号为CGMCC NO.8334，将L-天冬氨酸钠经生物转化反应后即得。本发明专利技术的四氢嘧啶生物生产方法，菌体重复使用五次每升发酵菌体共可以合成胞外四氢嘧啶87.5克,合成效率达到11.67g/L.d，均高于已报道的合成水平。本发明专利技术提供的生产四氢嘧啶的方法，对四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种微生物发酵生产四氢嘧啶的方法。
技术介绍
四氢嘧啶(1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid；ectoine)是一种在耐盐及嗜盐微生物中应用最为广泛的渗透压调节物。四氢嘧啶分子具有高度水溶性、不带电荷的特点，在高盐环境下细胞可通过四氢嘧啶的高浓度积累提高胞内渗透压，却不会影响胞内生物大分子正常的生理功能。研究表明在高盐、高温、冷冻和干燥等逆境下四氢嘧啶对核酸、蛋白质、细胞膜及整个细胞可提供保护作用，因此在生物制剂、化妆品生产和制药等领域具有广泛的应用前景。四氢嘧啶的生产传统工艺是利用嗜盐或耐盐微生物在高盐环境下合成积累四氢嘧啶，而在低盐环境下释放四氢嘧啶的特性，采用“细菌挤奶（Bacterial milking）”的方法，通过渗透压多次循环冲击实现四氢嘧啶的高效分泌合成。该方法使用高盐培养基易对设备造成腐蚀，而且发酵产物成份复杂，增加了下游纯化工艺的难度，使得四氢嘧啶的生产成本居高不下，严重制约了四氢嘧啶的大规模应用。目前现有的生产方法严重制约了四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用，因此开发一种高效的四氢嘧啶生产方法从而降低其生产成本，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种重组大肠杆菌高密度培养生产四氢嘧啶的方法。本专利技术提供的一种制备四氢嘧啶的方法，包括在含L-天冬氨酸钠的溶液中加入重组大肠杆菌，经生物转化反应后即得；其中，所述重组大肠杆菌是表达了SEQ ID №：2所示蛋白、SEQ ID №：3所示蛋白和SEQ ID №：4所示蛋白的；所述重组大肠杆菌为含有具有下述任一核苷酸序列的核酸片段的重组大肠杆菌：1）序列表中SEQ ID №：1所示的核苷酸序列；2）编码序列表中SEQ ID №：2、SEQ ID №：3和/或SEQ ID №：4所示蛋白质序列的多核苷酸序列；3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4）与1）或2）或3）限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。所述方法中，所述重组大肠杆菌具体为将重组载体导入出发大肠杆菌后得到的重组菌；所述重组载体具体为在出发载体pBAD/HisA的多克隆位点插入具有SEQ ID №：1所示核酸序列的DNA片段所得的质粒；具体的，所述出发大肠杆菌为带有ΔaraBAD阿拉伯糖代谢缺陷性状的大肠杆菌；再具体的，所述出发大肠杆菌为大肠杆菌BW25113(rrnB3ΔlacZ4787hsdR514Δ(araBAD)567Δ(rhaBAD)568rph-1)。所述重组载体具体为pBAD-EctABC，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID №.5所示。所述方法中，所述重组大肠杆菌具体为大肠埃希氏菌Escherichia coli BW-pBAD-ectABC CGMCC NO.8334。所述方法中，所述含L-天冬氨酸钠的溶液由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述含L-天冬氨酸钠的溶液中的浓度如下：所述方法中，所述生物转化反应的条件包括：转化温度为30℃，控制生物转化反应体系的溶氧在20％以上，和维持pH至7.0。具体的，通过调整搅拌速度和通气量控制生物转化反应体系的溶氧在20％以上，所述搅拌速度为500转/分钟，通气量为2L/min；具体的，通过2.7M氨水和1M柠檬酸水溶液维持pH至7.0。所述方法中，所述生物转化反应的过程包括：将所述重组大肠杆菌进行诱导培养，得到含有表达了SEQ ID №：2所示蛋白、SEQ ID №：3所示蛋白和SEQ ID №：4所示蛋白的重组大肠杆菌的诱导培养液；向所述诱导培养液中加入所述含L-天冬氨酸钠的溶液至L-天冬氨酸钠终浓度为200mM；转化培养至葡萄糖被消耗完，开始补加所述含L-天冬氨酸钠的溶液，所述含L-天冬氨酸钠的溶液的流加速度为40mL/h，继续进行转化培养，继续转化培养过程中一直补加所述含L-天冬氨酸钠的溶液；转化培养结束即得四氢嘧啶转化液。所述方法中，所述“将所述重组大肠杆菌进行诱导培养，得到含有表达了SEQ ID №：2所示蛋白、SEQ ID №：3所示蛋白和SEQ ID №：4所示蛋白的重组大肠杆菌的诱导培养液”的方法包括下述1）和2）：1）菌体培养过程：将300mL所述重组大肠杆菌的种子液接种于2.7L含100μg/ml氨苄青霉素的发酵培养基中，搅拌培养至葡萄糖消耗完时流加补料培养基，补料培养基的流加速度为50mL/h，流加至菌体密度OD600达到50，菌体培养过程结束，进入诱导培养阶段；2）诱导培养过程：将上述菌体培养后的发酵液的温度降至30℃，加入L-阿拉伯糖，使得L-阿拉伯糖终浓度为1g/L，进行诱导培养；诱导培养过程中要一直流加补料培养基，补料培养基的流加速度调至20mL/h；当重组蛋白EctABC的表达量不再增加时，诱导培养过程结束；所述菌体培养的条件为：培养温度为37℃，控制菌体培养体系的溶氧在20％以上，和维持pH至7.0；具体的，通过调整搅拌速度和通气量控制菌体培养体系的溶氧在20％以上，所述搅拌速度为500－800转/分钟，通气量为3L/min；具体的，通过2.7M氨水和1M磷酸维持pH至7.0；所述诱导培养的条件为：培养温度为30℃，控制诱导培养体系的溶氧在20％以上，和维持pH至7.0；具体的，通过调整搅拌速度和通气量控制诱导培养体系的溶氧在20％以上，所述搅拌速度为500－800转/分钟，通气量为3L/min；具体的，通过2.7M氨水和1M磷酸维持pH至7.0；每1L发酵培养基的配制：葡萄糖10g,(NH4)2HPO48g,KH2PO413.3g,MgSO4·7H2O1.2g,柠檬酸1.7g,微量盐溶液10mL,用水定溶至1L，5M NaOH调至pH7.0；每1L补料培养基的配制：葡萄糖400g,MgSO4·7H2O10g,微量盐溶液20mL,用水定容至1L；每1L微量盐溶液的配制：FeSO4·7H2O10g,ZnSO4·7H2O2.25g,CuSO4·5H2O1g,MnSO4·5H2O0.5g,Na2B4O7·10H2O0.23g,CaCl2·2H2O2g,(NH4)6Mo7O240.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备四氢嘧啶的方法，包括在含L‑天冬氨酸钠的溶液中加入重组大肠杆菌，经生物转化反应后即得；其中，所述重组大肠杆菌是表达了SEQ ID №：2所示蛋白、SEQ ID №：3所示蛋白和SEQ ID №：4所示蛋白的；所述重组大肠杆菌为含有具有下述任一核苷酸序列的核酸片段的重组大肠杆菌：1）序列表中SEQ ID №：1所示的核苷酸序列；2）编码序列表中SEQ ID №：2、SEQ ID №：3和/或SEQ ID №：4所示蛋白质序列的多核苷酸序列；3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4）与1）或2）或3）限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。

【技术特征摘要】
1.一种制备四氢嘧啶的方法，包括在含L-天冬氨酸钠的溶液中加入重组大肠杆
菌，经生物转化反应后即得；其中，所述重组大肠杆菌是表达了SEQ ID №：2所示蛋
白、SEQ ID №：3所示蛋白和SEQ ID №：4所示蛋白的；
所述重组大肠杆菌为含有具有下述任一核苷酸序列的核酸片段的重组大肠杆菌：
1）序列表中SEQ ID №：1所示的核苷酸序列；
2）编码序列表中SEQ ID №：2、SEQ ID №：3和/或SEQ ID №：4所示蛋白质
序列的多核苷酸序列；
3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序
列；
4）与1）或2）或3）限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同功能
蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的
为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌具体为大肠埃
希氏菌Escherichia coli BW-pBAD-ectABC CGMCC NO.8334。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含L-天冬氨酸钠的溶液
由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述含L-天冬氨酸钠的溶液中的浓度如下：
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述生物转化反应的条件
包括：转化温度为30℃，控制生物转化反应体系的溶氧在20％以上，和维持pH至7.0。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述生物转化反应的过程
包括：将所述重组大肠杆菌进行诱导培养，得到含有表达了SEQ ID №：2所示蛋白、
SEQ ID №：3所示蛋白和SEQ ID №：4所示蛋白的重组大肠杆菌的诱导培养液；向
所述诱导培养液中加入所述含L-天冬氨酸钠的溶液至L-天冬氨酸钠终浓度为200mM；
转化培养至葡萄糖被消耗完，开始补加所述含L-天冬氨酸钠的溶液，所述含L-天冬氨
酸钠的溶液的流加速度为40mL/h，继续进行转化培养，继续转化培养过程中一直补加
所述含L-天冬氨酸钠的溶液；转化培养结束即得四氢嘧啶转化液。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述“将所述重组大肠杆
菌进行诱导培养，得到含有表达了SEQ ID №：2所示蛋白、SEQ ID №：3所示蛋白
和SEQ ID №：4所示蛋白的重组大肠杆菌的诱导培养液”的方法包括下述1）和2）：
1）菌体培养过程：将300mL所述重组大肠杆菌的种子液接种于2.7L含100μg/ml
氨苄青霉素的发酵培养基中，搅拌培养至葡萄糖消耗完时流加补料培养基，补料培养
基的流加速度为50mL/h，流加至菌体密度OD600达到50，菌体培养过程结束，进入诱
导培养阶段；
2）诱导培养过程：将上述菌体培养后的发酵液的温度降至30℃，加入L-阿拉伯
糖，使得L-阿拉伯糖终浓度为1g/L，进行诱导培养；诱导培养过程中要一直流加补料
培养基，补料培养基的流加速度调至20mL/h；当重组蛋白EctABC的表达量不再增加
时，诱导培养过程结束；
所述菌体培养的条件为：培养温度为37℃，控制菌体培养体系的溶氧在20％以
上，和维持pH至7.0；
所述诱导培养的条件为：培养温度为30℃，控制诱导培养体系的溶氧在20％以
上，和维持pH至7.0；
每1L发酵培养基的配制：葡萄糖10g,(NH4)2HPO48g,KH2PO413.3g,MgSO4·7H2O
1.2g,柠檬酸1.7g,微量盐溶液10mL,用水定溶至1L，5M NaOH调至pH7.0；
每1L补料培养基的配制：葡萄糖400g,MgSO4·7H2O10g,微量盐溶液20mL,用
水定容至1L；
每1L微量盐溶液的配制：FeSO4·7H...

【专利技术属性】
技术研发人员：董志扬，何永志，张山，毕建成，
申请(专利权)人：南京众惠生物材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32