本发明专利技术涉及一种产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活菌制剂的制备方法，属于微生物应用领域。本发明专利技术利用植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL CGMCC No.6936菌株，经过活化、扩大培养、高密度发酵、离心、冻干保护剂的添加、预冻及冷冻干燥等工序制备活菌制剂。本发明专利技术首先选取油菜籽蛋白胨作为替代氮源，降低培养基成本的同时，优化了植物乳杆菌的培养条件，并利用5L全自动发酵罐进行高密度发酵，在优化后的低成本培养基及培养条件下，发酵液活菌数可达1010CFU/mL以上。本发明专利技术利用马铃薯浆作为冻干保护剂基质，确定冻干保护剂较优组合配方，使植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL存活率达到60％以上，活菌量可达1011CFU/g以上。本发明专利技术制备的活菌制剂原料价格低廉，活菌含量较高，可为家禽新型饲料添加剂的开发提供良好的基础，提供重大的经济价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物
的乳酸菌活菌制剂的制备方法，属于微生物应用领域，可用于家禽畜牧业中饲用活菌制剂等微生态制剂的生产。
技术介绍
乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名。将益生乳酸菌添加到食品中不仅可以提高食品的营养价值，而且具有保健作用，如促进蛋白质等营养物质的吸收，产生维生素B族等大量有益物质，改善人体肠道功能，恢复人体肠道内菌群平衡，增强人体免疫力，抗肿瘤、抗衰老，还具有降胆固醇、降血脂、降血压等作用。目前市场上的乳酸菌制品主要包括酸乳，酸乳饮料，活菌制剂等。本专利涉及的一株产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL菌株，经过试验证实其不仅对单增李斯特氏菌有很好的抑菌效果，而且耐受胃肠逆环境(耐受胆汁和胃酸)，因此可以顺利通过胃肠定殖于肠道中产生细菌素和乳酸，具有抑制某些腐败菌和致病菌的作用。本专利将该菌株制备成活菌制剂作为生物添加剂应用于家禽养殖业，可以达到预防家禽肠道疾病的目的。目前，国内专利有关各种活菌制剂的制备方法较多，例如北京市农林科学院季海峰和苏布敦格日乐申请的“一种猪源植物乳杆菌植物亚种冻干制剂及其制备方法”(CN200910082441.X)是植物乳杆菌植物亚种经扩培、离心、加入保护剂、真空干燥，获得高存活率的植物乳杆菌植物亚种菌粉；黑龙江八一农垦大学于长青、钱丽丽和姚笛申请的“含有活性物质的植物乳杆菌活菌制剂及其制备方法”(CN201010283999.7)是在植物乳杆菌活菌粉中加入低聚糖，制备一种可在温室稳定存放的活菌制剂；上海环伟生物科技有限公司张琴和陈建吕申请的“一种复合微生物活菌制剂及其制备方法和应用”(ZL200810034746)是一种片球菌、酵母菌和芽孢杆菌复合微生物活菌制剂。但关于利用产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL制备活菌制剂，并利用油菜籽蛋白胨作为替代氮源，马铃薯浆作为基质保存生物制剂中活菌的方法国内外未见相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活菌制剂的制备方法。所述方法中，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL，已于2012年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所)，其保藏号为：CGMCC No.6936。在MRS培养基中培养2d，菌株Zhang-LL菌体呈短杆状，0.5×1.33～2.0μm，单个，成对或呈短链状排列，不生芽孢，革兰氏阳性。所述方法中，植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活化2～3代后，将活化好的菌液以2％(V/V，体积分数)的接种量接种至改良MRS液体培养基中，37℃培养12h，获得的培养液备用。上述方法中，改良MRS液体培养基：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，柠檬酸三铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g，水1L，pH6.5，121℃灭菌15min所述方法中，植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵培养基是在改良MRS培养基的基础上进行氮源的替代及优化的。培养基和发酵条件优化采用单因素多水平和四因素三水平[L9(34)]正交试验，以测定发酵液活菌数为指标，分析并确定了高活菌数发酵液的优化的培养基和发酵条件。最终确定氮源(501油菜籽蛋白胨)含量3.0％、发酵温度34℃、发酵液pH 6.5、发酵接种量7％为最优发酵培养条件。优化的植物乳杆菌植物亚种的发酵培养基一一501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基由以下成分组成：501油菜籽蛋白胨30.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温801.0mL/L，乙酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.25g/L，pH6.5，121℃灭菌15min。所述方法中，应用上述优化后的发酵培养条件，利用5L全自动发酵罐进行高密度发酵，将Zhang-LL菌株的扩大培养液按7％(V/V，体积分数)的接种量接种至发酵罐中，利用发酵罐自动控温系统保证发酵温度为34℃，发酵过程中以流加15％(V/V，质量体积比浓度)的灭菌Na2CO3溶液控制发酵液pH为6.5，转速为150r/min的条件下发酵16h，获得发酵液。上述方法中，5L全自动发酵罐由上海高机生物工程有限公司生产，其型号为BIOF6005GBN。所述方法中，将5L发酵罐中的发酵液在4℃条件下，8000r/min离心10min，收集菌泥。 所述方法中，将收集得到的植物乳杆菌植物亚种菌泥与1/10原发酵液体积的马铃薯浆混合，采用单因素多水平试验，确定植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL的冻干保护剂组合配方为(V/V，质量体积比浓度)：3％脱脂乳+2％谷氨酸钠，混合均匀后，得到浓缩发酵剂。上述方法中，马铃薯浆是由新鲜的马铃薯去皮、切块、经九阳牌食物料理机打浆制成的。所述方法中将浓缩发酵剂在-35℃冰箱中预冻13h至完全冻结状态，得到预冻发酵剂，利用真空冷冻干燥机将预冻发酵剂于冻干温度-55℃、真空度0.08mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到冻干发酵剂。所述方法中，经过菌落计数，所得到的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵液活菌数可达1010CFU/mL以上，冻干活菌制剂的活菌数可达1011CFU/g以上，菌株的存活率达到60％以上。此种活菌制剂利用油菜籽蛋白胨全部替代改良MRS培养基配方中的氮源，即替代了改良MRS培养基中的胰蛋白胨、牛肉膏及酵母浸粉，不仅降低了培养基的成本，而且还明显增加了发酵液乳酸菌的活菌数量。因此，利用马铃薯浆作为保护基质可以进一步降低活菌制剂的成本，为家禽生物饲料添加剂的生产和产业化提供新思路。上述方法得到的产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活菌制剂的制备方法及其活菌制剂产品，以及专利菌种属于本专利技术保护范围。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量对体积的百分含量。实施例1、植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活菌制剂及其制备方法1、确定植物乳杆菌植物亚种低成本发酵培养基中的氮源在发酵温度37℃、发酵液接种量2％、发酵时间16h、发酵液pH 6.5的条件下，选取发酵培养基为改良MRS培养基，分别用501油菜籽蛋白胨、502油菜籽蛋白胨、503油菜籽蛋白胨替代改良MRS中的氮源，进行发酵试验，测定不同发酵培养基发酵液中Zhang-LL菌株的活菌数量，以确定最适发酵培养基的氮源种类，试验结果见表1。表1 氮源种类对发酵液Zhang-LL菌株活菌数的影响由表1可知，当培养基中氮源为501油菜籽蛋白胨时，发酵液活菌数达到最大值，为2.38×109CFU/mL，故选定501油菜籽蛋白胨为培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang‑LL CGMCC No.6936。
【技术特征摘要】
1.植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL
CGMCC No.6936。
2.一种利用产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL制备活菌制剂的方法，
其特征在于：植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)
Zhang-LL油菜籽蛋白胨改良MRS发酵培养基由以下成分组成：501油菜籽蛋
白胨30.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温801.0mL/L，乙酸钠
5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.25g/L；将植物乳杆菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：张红星，刘慧，谢远红，于立娟，金君华，段慧霞，熊利霞，高秀芝，
申请(专利权)人：北京北农红泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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