经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法技术

本发明专利技术公开一种经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，首先在基底上铺设一层薄膜，再在薄膜上制备纳米坑阵列，经进一步基底修饰(O2等离子体处理基底进行羟基化，再经修饰使之生物素化)，去除薄膜后形成可连接生物大分子的活性纳米点阵列，因纳米点足够小，只能连接一个生物大分子；最后清洗基底，获得高密度的单分子生物芯片。本发明专利技术获得的目的生物芯片主要特征是单分子、高通量、多功能，可用于超灵敏单分子酶联免疫吸附分析、基于杂交的DNA变异检测、单分子DNA合成和连接测序以及单细胞RNA测序等领域。

【技术实现步骤摘要】
经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法
本专利技术涉及一种生物芯片制作技术，具体是一种生物大分子(即DNA、RNA和蛋白质)高密度单分子芯片的制作方法。
技术介绍
高密度生物大分子(DNA、RNA和蛋白质)单分子芯片，即每一个样点只有一个生物大分子，样点间距达到光学分辨率极限，可以实现单位面积的数据量最大化；各样点上的单分子，可通过分子生物学手段修饰后用作“诱饵”，捕获靶分子，既可用于分子间如抗原与抗体间的相互作用、DNA杂交检测单核苷酸多态性、拷贝数变异和比较基因组杂交芯片等，也可用于DNA合成法测序、连接法测序等，将第二代测序技术转换为第三代测序技术。但是，生物大分子单分子芯片的制作难度大，传统的方法采用稀释的生物大分子溶液铺设，有很大的随机性，有许多分子因相互重叠而无法观察；此外，基底上部分区域样点极少或没有样品，检测效率降低。迄今，还没有比较有效的高密度生物大分子单分子芯片制作技术。经对现有文献检索发现，2010年，CompleteGenomics(华大基因)公司在SCIENCE(第327卷，第78-81页)发表了题为“HumanGenomeSequencingUsingUnchainedBaseReadsonSelf-AssemblingDNANanoarrays”论文。该项技术将经滚环复制后形成的DNA纳米球样品固定到预先制备好的硅基阵列中，大大增加了芯片表面检测样点的密度，有效地提高了DNA测序通量和试剂的使用效率。但是，滚环复制后进入阵列的DNA并非来自天然基因组的单拷贝片段，而是短片段的多重拷贝，也即该芯片不是真正意义上的单分子DNA芯片。本专利技术要解决的技术问题是指提供单分子状态的高通量生物芯片。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的单分子芯片制作技术，即经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片，该方法可将单个生物大分子固定于纳米阵列，通过单分子样点的间距控制，建立高密度、多功能生物大分子的单分子芯片。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：在基底上铺设一层薄膜，再在薄膜上制备纳米坑阵列，经进一步基底修饰(O2等离子体处理基底进行羟基化，再经修饰使之生物素化)，去除薄膜后形成可连接生物大分子的活性纳米点阵列，因纳米点足够小，只能连接一个生物大分子；最后清洗基底，获得高密度的单分子生物芯片。所述方法具体按照如下步骤实施：第一步，纳米阵列基底的制备：在洁净的基底上镀一层薄膜，厚度不超过1个生物大分子的直径；第二步，纳米坑阵列的制备：刻蚀薄膜，直至基底暴露，制作出直径小于1个生物大分子的纳米坑阵列；第三步，活性纳米点阵列的制备：通过化学方法修饰基底，使之各部分携带上活性基团A，去除薄膜后形成带活性基团A的纳米点阵列；第四步，单分子生物芯片的制备：将携带可以与活性基团A发生连接反应的活性基团B的生物大分子，在连接溶液中与基底发生连接反应；因为纳米点的直径小于2个生物大分子，因此，各个纳米点只能连接1个生物大分子，反应完成后经清洗，获得高密度生物大分子单分子芯片。优选地，所述的基底，可以采用常用的基底材料，包括但不限于石英，玻璃片，硅片，云母片等。优选地，所述的薄膜，包括但不限于PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)光刻胶正胶、PMMA/MA共聚物正胶和LIGA正胶等材料。优选地，所述的在基底上镀一层薄膜，可以采用旋涂光刻胶等方法，薄膜厚度不大于生物大分子的直径。优选地，所述的纳米点，按照所制作的单分子生物芯片的要求，保证其直径小于1个生物大分子的直径，即单个活性纳米点中最多只能连接一个生物大分子。优选地，根据需要，所述的纳米点中心间距可以≤1000纳米，这是根据所采用的荧光分子的波长而定，两个相邻的荧光分子有分辨率极限，当前的高分辨率光学显微镜的分辨极限为200纳米，随着科学技术进步，有了突破当前分辨极限的显微镜，本专利技术的纳米孔中心间距，还可以随之降低；本专利技术也可以制备纳米点中心间距超过1000纳米的阵列，但芯片上的样点量将大幅度下降，检测的信息量也会随之降低。优选地，所述的生物大分子，可以是蛋白质的单体、二聚体和多聚体(包括抗体)，也可以是单个蛋白质携带单根核酸分子的复合物；所述核酸分子，可以是DNA，也可以是RNA。优选地，所述的活性基团A与B，是指二者能够发生免疫绑定、直接或介导形成共价键的活性基团对，凡是能够实现该目的的活性基团对均可，包括但不限于：生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗体、氨基-环氧基、氨基-羧基(包括羧基的活化形式如琥珀酰亚胺碳酸酯等)、氨基-羰基、巯基-马来酰亚胺、巯基-环氧基、巯基-巯基、巯基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基等。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：与国内外同类芯片相比，本专利技术采用的制备工艺简单，适于大规模的单分子芯片制备，单分子样点间距可控，单分子连接效率接近100％。可用于超灵敏单分子酶联免疫吸附分析、基于杂交的DNA变异检测、单分子DNA合成和连接测序以及单细胞RNA测序等。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为规则纳米点阵列的制备流程示意图。具体实施方式以下实例将结合附图对本专利技术作进一步说明。全部实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例及附图所采用的方法。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造商所建议的条件进行。以下实施例中，对于制备得到的生物大分子单分子芯片的检测：用荧光分子标记生物大分子，清洗后，在高分辨荧光显微镜下检测。当然，所述的用荧光分子标记生物大分子后检测，也可以在固定生物大分子前，用荧光分子标记生物大分子后检测。单分子芯片的质量检测，可以采用荧光标记的方法在荧光显微镜下检测，也可以采用非荧光检测方法，如原子力显微镜检测。实施例1第一步，在Piranha溶液和无离子水清洗后的硅基底上旋涂厚度10nm的光刻胶PMMA。第二步，用电子束光刻技术在底片光刻显影出30nm的纳米坑图形(纳米点直径控制在只能容纳1个核酸装载工具)，通过掩模版设计将纳米坑间距控制在500nm。第三步，将显影后的基底用等离子体处理使硅表面羟基化；丙酮清洗基底去除PMMA薄膜，获得羟基化纳米点阵列。第四步，用APTES溶液处理基底，使纳米点表面氨基化，清洗后用Biotin-NHS处理，使纳米点表面选择性生物素化。第五步，通过免疫反应，将四聚体抗链霉生物素-单条DNA复合物固定到纳米点，因纳米点直径足够小，位阻效应只允许连接一个复合物，因此，制备出的DNA阵列为高密度单分子DNA芯片。实施效果：本实施例可获得使阵列中纳米坑的单分子DNA装载效率接近100％的高密度单分子芯片，样点间距约500nm。经进一步分子生物学处理，该芯片可用于单分子水平的连接测序、合成测序、比较基因组杂交和单核苷酸多态性检测等，四色荧光检测时，样点间距与光学检测极限相匹配。实施例2第一步，在现玻璃的云母基底上旋涂厚度10nm光刻胶PMMA/MA，使之不超过后续单个分子的直径。第二步，采用电子束光刻，并显影实现直径小于20nm的纳米点阵列，通过掩模版设计将纳米坑间距控制在200nm。第三本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于包括如下步骤：第一步，纳米阵列基底的制备：在洁净的基底上镀一层薄膜，厚度不超过1个生物大分子的直径；第二步，纳米坑阵列的制备：刻蚀薄膜，直至基底暴露，制作出直径小于1个生物大分子的纳米坑阵列；第三步，活性纳米点阵列的制备：通过化学方法修饰基底，使之各部分携带上活性基团A，去除薄膜后形成带活性基团A的纳米点阵列；第四步，单分子生物芯片的制备：将携带可以与活性基团A发生连接反应的活性基团B的生物大分子，在连接溶液中与基底发生连接反应；因为纳米点的直径小于1个生物大分子，因此，各个纳米点只能连接1个生物大分子，反应完成后经清洗，获得高密度生物大分子单分子芯片。

【技术特征摘要】
1.一种经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于包括如下步骤：第一步，纳米阵列基底的制备：在洁净的基底上镀一层薄膜，厚度不超过1个生物大分子的直径；第二步，纳米坑阵列的制备：刻蚀薄膜，直至基底暴露，制作出直径小于1个生物大分子的纳米坑阵列；第三步，活性纳米点阵列的制备：通过化学方法修饰基底，使之各部分携带上活性基团A，去除薄膜后形成带活性基团A的纳米点阵列；第四步，单分子生物芯片的制备：将携带可以与活性基团A发生连接反应的活性基团B的生物大分子，在连接溶液中与基底发生连接反应；因为纳米点的直径小于1个生物大分子，因此，各个纳米点只能连接1个生物大分子，反应完成后经清洗，获得高密度生物大分子单分子芯片。2.根据权利要求1所述的经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于：所述纳米坑中心间距控制在≤1000纳米。3.根据权利要求1所述的经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于：所述的纳米点，按照所制作的单分子生物芯片的要求，保证其直径小于1个生物大分子的直径，即单个活性纳米点中最多只能连接一个生物大分子。4.根据权利要求1所述的经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于：所述的生物大分子是蛋白质的单体、二聚体或多聚体，或是单个蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：王志民，程秀兰，吕鹏雨，杨秋萍，王跃，何珊珊，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31