产气荚膜梭菌α毒素人源化单链抗体7D制造技术

本发明专利技术公开了产气荚膜梭菌α毒素人源化单链抗体7D，它是从噬菌体抗体库Source bioscience筛选出来的，是全人源抗产气荚膜梭菌α毒素抗体，既可以实现中和毒素的治疗作用，同时克服了异源性抗体的多种副作用，免除了异源性抗体进行人源化改造的繁琐步骤和高成本，由于单链抗体分子量小，体内穿透能力强，迅速到达受损组织和细胞发挥抗毒素作用，因此达到经济和高效的双重目的。α毒素与产气荚膜梭菌其他类型毒素具有一定的同源性，该抗体药物有可能对其他类型的毒素具有抑制和治疗效果，也可作为检测试剂检测产气荚膜梭菌α毒素。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程及疾病防治领域，具体地涉及产气荚膜梭菌a毒素人源化 单链抗体7D及其在产气荚膜梭菌a毒素中毒诊断和治疗方法的应用。
技术介绍
产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens)亦称魏氏梭菌（C.welchii)，为革兰氏 阳性菌，外形为两端钝圆的粗大杆状，专性厌氧，有荚膜无鞭毛，是引起人食物中毒、气性坏 疽、抗生素相关性腹泻以及动物的肠毒血症和痢疾等疾病的主要病原菌。产气荚膜梭菌一 般条件下很难形成芽孢，在无糖培养基中有利于形成芽孢，多数产气荚膜梭菌菌株可形成 荚膜，该细菌DNA的G+Cmol%为24-27。在基本培养基上能正常生长，适宜的生长温度在 37-47°C，呈现出圆形、凸起、光滑、半透明、边缘整齐、无迁徙生长现象。产气荚膜梭菌是一 种厌氧菌，分离培养需要特殊的设备和试剂，一般实验室难以开展该菌的研究，因此长久以 来国内对厌氧菌及其在食物中毒中的作用也缺少认识，虽然国外有厌氧菌引起的食物中毒 的报道，但国内较少见报道，该菌作为一种条件致病菌，广泛存在于自然界的水源、土壤及 人和动物肠道之中。当食入每克含菌量达1〇 5以上的污染食品时，即可引起食物中毒，临床 表现为恶心呕吐，腹部绞痛，多次腹泻，不发热等现象。到目前为止，已发现的该菌外毒素有 16种（a、3、y、6、e、n、9、i、K、A、]i和v等)，但仅有几种毒素，即a(CPA)、 3 (CPB)、e(ETX)、i(ITX)毒素以及产气荚膜梭菌溶素0 (PF0)、肠毒素（CPE)、P2(CPB2) 毒素被认为是该菌的主要致病性毒素。根据产气荚膜梭菌产生四种致死性毒素（a、卩、e、 i毒素）的能力，将其分为五种血清类型，即A、B、C、D和E型，其中A型主要引起人类的食 物中毒和抗生素相关性腹泻，也可以引起动物的气性坏疽，还可以引起牛、羔羊、驯鹿、仔猪 和家兔的肠毒血症；B型菌主要引起羔羊痢疾，还可以引起狗、牛和羊等肠毒血症或坏死性 肠炎；C型菌主要是绵羊猝狙的病原菌，也能引起羔羊、牛、仔猪和绵羊的肠毒血症、坏死性 肠炎以及人的坏死性肠炎；D型菌引起羊、牛、仔猪以及灰鼠的肠毒血症；E型菌可致犊牛、 羔羊肠毒血症，但是很少发生，其中各型均能产生a毒素，可见a毒素是产气荚膜梭菌的 主要毒素和致病因子。产气荚膜梭菌a毒素（Clostridiumperfringensalpha-toxin，CPA)是引起人 畜的创伤性气性坏疽和人类食物中毒的主要致病因子。a毒素是一种依赖于锌离子的多功 能金属酶，具有膜磷脂C(PLC)和鞘磷脂酶（SMase)两种酶活性，能够同时水解细胞膜的磷 脂酰胆碱和鞘磷脂，破坏细胞膜的完整性，导致细胞裂解，具有细胞毒性、溶血活性、皮肤坏 死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性。产气荚膜梭菌a毒素是一种不畏氧的细菌毒 素，可以水解卵磷脂形成磷脂胆碱和不溶性的甘油二脂，使红细胞发生溶血和分解卵黄磷 月旨。纯化浓缩的产气荚膜梭菌a毒素作为生物武器可以制成气溶胶形式释放，也可以释放 在水和食物中，该生物战剂可引起人多系统多器官的严重反应，如缺乏食欲、恶心呕吐、胃 部痉挛疼痛、脓血样腹泻；呼吸困难、喘息咳嗽、口腔咽喉疼痛、痰中带血；皮肤灼痛、红肿、 瘙痒、皮疹或水泡，更严重的可以引起死亡。a毒素是第一个被发现既有酶活性又有毒素特 性的细菌蛋白，具有冷热溶血效应，即a毒素在37°C与红细胞作用时，红细胞并不发生裂 解，只有当红细胞变冷至4°C时，才会发生裂解，这种冷热溶血效应，发现在小鼠红细胞、家 兔红细胞、绵羊红细胞和马红细胞上。a毒素对胰酶敏感，2. 5%的胰酶与a毒素在37°C作 用1h，即可使其完全失活。另外，把a毒素加热至60°C-70°C时，就可以使其失活，当进一 步加热至l〇〇°C时，有的可以恢复部分活性。a毒素结构基因大小为1194bp，编码产物由 398个氨基酸组成，其中有28个氨基酸是信号肽，其余的370个氨基酸构成成熟蛋白，相对 分子量为43000Da,等电点pi为5. 1。a毒素分为两个结构域，g卩a螺旋结构的N端结构 域以及参与膜蛋白结合的C端结构域，经大量实验证明，a毒素的N端与C端具有不同的 活性，N端具有磷脂酶C活性，C端具有鞘磷脂酶活性，只有两者协同，才能具有溶血活性与 致死活性。a毒素是产气荚膜梭菌最重要的致病因子，至今尚无有效的治疗方法。关于抗 a毒素人源化抗体的研究，在国内基本属于空白，研究抗产气荚膜梭菌a毒素治疗性抗体 有广阔的应用前景。 20世纪90年代，组合化学技术与基因工程抗体技术相互结合产生了抗体库技术， 抗体库技术就是用基因克隆技术克隆全套抗体重链和轻链可变区基因，然后重组到特定的 原核表达载体中，再转化大肠杆菌表达有功能的抗体分子片段，并通过亲和筛选获得特异 性抗体可变区基因的技术。根据使用的筛选技术不同，抗体库经历了组合抗体库、噬菌体 抗体库、核糖体展示库三个阶段，其中噬菌体抗体库是迄今为止，发展最成熟、应用最广泛 的抗体技术，噬菌体抗体库是指在丝状噬菌体表面表达Fab抗体或者scFv抗体，这称为噬 菌体抗体，然后再利用基因工程手段克隆B细胞全套可变区基因，插入到表达载体，并在噬 菌体表面表达，形成大量的噬菌体抗体，构成噬菌体抗体库，如由MRCHGMP资源中心创建的 HumanSingleFoldscFvLibrariesI+J(TomlinsonI+J)，该文库包含至少有 108个 不同的重组单链抗体基因片段，利用其能够淘选出抗a毒素单链抗体基因片段。为研制a 毒素中毒的特效药物奠定了基础，提供新的依据。目前，人源单链抗体的制备，大部分都是 利用噬菌体展不技术构建一个依托于噬菌体载体或者噬菌粒载体的噬菌体展不文库，通过 目的抗原与抗体特异性结合，经过几轮淘选和富集过程，筛选到所需要的阳性克隆或者目 的抗体，利用ELISA和PCR等技术对其进行定性定量分析。
技术实现思路
本专利技术的目的是，为克服异源性抗体的多种副作用，免除异源性抗体进行人源化 改造的繁琐步骤和高成本，而提供一种体分子量小，体内穿透能力强，迅速到达受损组织和 细胞发挥抗毒素作用的，产气荚膜梭菌a毒素人源化单链抗体7D。 产气荚膜梭菌a毒素人源化单链抗体7D，它的碱基序列如SEQIDN0. 3所示。产气荚膜梭菌a毒素人源化单链抗体7D，它的氨基酸序列如SEQIDNO. 6所示。产气荚膜梭菌a毒素人源化单链抗体7D在制备治疗和预防产气荚膜梭菌a毒 素中毒的药物的应用。 一种检测产气荚膜梭菌a毒素的检测试剂，它包括氨基酸序列如SEQIDN0. 6所 示的产气荚膜梭菌a毒素人源化单链抗体7D。 本专利技术提供了产气荚膜梭菌a毒素人源化单链抗体7D，它是从噬菌当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
产气荚膜梭菌α毒素人源化单链抗体7D，它的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张国利，于佳，田园，朱进，刘雨玲，岳玉环，吴广谋，徐艳玲，史飞，赵鑫，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22