产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种特异检测产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌感染的荧光定量PCR检测试剂盒，包括：a)荧光定量反应液、b)产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品、c)阴性质控品；其中荧光定量反应液包含有引物2对和探针1对，为产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02以及荧光探针cpap；产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02以及荧光探针cpep，本发明专利技术具有以下优点：能够对肠毒素cpe阳性的产气荚膜梭菌进行快速诊断；特异性好，灵敏度高，假阳性率低；检测速度快，仅需1个半小时。

【技术实现步骤摘要】
产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒
本专利技术涉及一种特异检测产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌感染的荧光定量PCR检测试剂盒，属于细菌核酸检测领域，适用于临床及科研中对产气荚膜梭菌肠毒素阳性的快速定性定量检测。
技术介绍
产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一种重要的人畜共患病的病原体，广泛存在于环境中的土壤、水源、人和动物肠道中。该菌的致病性主要依据其产生各种毒素的能力，到目前为止，共发现至少15种以上的产气荚膜梭菌毒素，除了分型的四种分型致死性毒素α、β、ε、ι毒素外，其中所有型的产气荚膜梭菌均含有外毒素cpα，还发现了与人和动物疾病有密切关系的重要的新细菌毒素，如肠毒素(clostridiumperfringensenterotoxin,CPE)。虽然产肠毒素的产气荚膜梭菌约占产气荚膜梭菌的2～5％，但CPE阳性的产气荚膜梭菌可引起人的食物中毒、抗生素相关腹泻和散发性腹泻等非食源性胃肠疾病及动物胃肠疾病，与食品公共安全息息相关，目前根据国际最新标准，将检测样品中CPE阳性产气荚膜梭菌作为产气荚膜梭菌食物中毒的指标。已有多种免疫学方法用于检测临床样品中的肠毒素，但是存在有检测的局限性，免疫学检测方法检测的是毒素蛋白，易出现假阴性的检测结果。主要是由于检测的样品如腹泻粪便等肠毒素含量处于较低水平，另一方面由于肠毒素产生于该菌的芽孢阶段，在体外培养时，很难形成芽孢产生肠毒素蛋白，因此按照常规的免疫学检测方法不能从人工培养物中检测到。随着PCR技术的广泛应用，对产气荚膜梭菌的检测从传统方法过渡到以PCR及杂交探针为主的快速检测现代方法，目前根据产气荚膜梭菌的不同毒素建立了多重PCR检测方法，可对产气荚膜梭菌进行检测与分型。虽然PCR方法灵敏度较高，特异性强，但也有一些缺陷，不能够检测极低病毒含量的临床样品，如何改进和提高方法的特异性仍有待进一步的研究。荧光定量PCR检测技术在普通PCR的基础上又高了一个新的水平，无论敏感性、特异性与检测速度都具有显著优势。但它对引物和探针也提出了更高的要求。产气荚膜梭菌肠毒素cpe有两种基因型，一种是位于细菌染色体上，一种是细菌质粒上。现有技术关于产气荚膜梭菌抗原、抗体检测及荧光定量PCR技术的文献很少，未涉及到产气荚膜梭菌外毒素cpa和肠毒素cpe的诊断技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种利用荧光定量PCR技术特异检测含肠毒素cpe产气荚膜梭菌的荧光定量PCR快速检测试剂盒，该试剂盒能够特异灵敏地检测出产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性菌，从而达到快速诊断的目的。本专利技术为解决以上技术问题采用的技术方案是：产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)荧光定量反应液、b)产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品、c)阴性质控品；其中荧光定量反应液包含有引物2对和探针1对，为产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02以及荧光探针cpap；产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02以及荧光探针cpep，其中，产气荚膜梭菌外毒素cpa的引物序列为：上游引物cpa01：5’-GATTTGTAAGGCGCTTATTTGT-3’，下游引物cpa02：5’-ATAGCATGAGTTCCTGTTCCA-3’，荧光探针cpap：5’-CTACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTG-3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是TAMRA，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-2；产气荚膜梭菌肠毒素cpe的引物序列为：上游引物cpe01：5’-AGTGTAAATTAAGCTTTTGAGTCCA-3’，下游引物cpe02：5’-TAGCTGCTGCTACAGAAAGATTAA-3’，荧光探针cpep为5’-AAGGGTATGAGTTAGAAGAACGCCAATCA-3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-1。按上述方案，所述的荧光定量反应液由1×PCRbuffer(含Mg2+)，dNTPs0.5mM，Taq酶2U，产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02各0.4μM，荧光探针cpap为0.4μM，产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02各0.4μM，荧光探针cpep为0.4μM组成。按上述方案，所述的产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品为含有α毒素和cpe序列的克隆质粒，其中产气荚膜梭菌外毒素cpa的阳性质控品为构建的载体pUC57-cpa，其序列为：ATGAAAAGAAAGATTTGTAAGGCGCTTATTTGTGCTACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTGGGGCATCAACTAAAGTCTACGCTTGGGATGGAAAGATTGATGGAACAGGAACTCATGCTATGATTG；产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品为合成的长链构建的载体pUC57-cpe，其序列为AGATATAGAAAAAGAAATCCTTGATTTAGCTGCTGCTACAGAAAGATTAAATTTAACTGATGCATTAAACTCAAATCCAGCTGGTAATTTATATGATTGGCGTTCTTCTAACTCATACCCTTGGACTCAAAAGCTTAATTTACACTTAACAATTACAGCTACTGGACAAAAATATAGAATCTTAGCTAGCAAAATTGTTGATTTTAATATTTATTCAAATAATTTTAATAATCTAGTGAAATT。按上述方案，所述的阴性质控品是灭菌的无酶双蒸水。本专利技术建立的方法利用荧光定量技术，设计两条具有高特异性的荧光标记DNA探针，通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现检测到产气荚膜梭菌的外毒素基因cpa和肠毒素基因cpe。通过一次试验结果直接验证该菌是否为肠毒素阳性产气荚膜梭菌，克服了常规方法的局限性。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：1、能够对肠毒素cpe阳性的产气荚膜梭菌进行快速诊断，可以对危害公共食品安全的产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌进行有效的筛查，弥补了现有检测技术的空缺；2、特异性好，灵敏度高，假阳性率低。通过两对特异性引物高特异性扩增和两条荧光探针的高特异杂交双重控制，具有很高的准确性；反应过程由荧光检测系统实时监控，荧光检测系统对荧光信号具有很高的检测灵敏度；3、检测速度快，仅需1个半小时。没有后期处理，不用杂交、电泳、拍照等过程，所有试剂均是一次扩增，毋需开盖，不产生污染。附图说明图1是外毒素cpa标准品pUC57-cpa10倍梯度稀释进行荧光定量PCR所得到的扩增曲线，横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光强度，图中平行原理横坐标的直线代表荧光阀值，①～⑥依次为10倍稀释的外毒素cpa标准品；图2是根据外毒素cpa标准品pUC57-cpa10倍稀释进行荧光定量结果所制作的标准曲线，横坐标代表外毒素cpa标准品稀释倍数对数值，纵坐标代表循环数；图3是肠毒素cpe标准品pUC57-cpe10倍稀释进行荧光定量PCR所得到的扩增曲线，横坐标代表循环数，纵本文档来自技高网...

【技术保护点】
产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)荧光定量反应液、b)产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品、c)阴性质控品；其中荧光定量反应液包含有引物2对和探针1对，为产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02以及荧光探针cpap；产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02以及荧光探针cpep，其中，产气荚膜梭菌外毒素cpa的引物序列为：上游引物cpa01：5’‑GATTTGTAAGGCGCTTATTTGT‑3’，下游引物cpa02：5’‑ATAGCATGAGTTCCTGTTCCA‑3’，荧光探针cpap：5’‑CTACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTG‑3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是TAMRA，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ‑2；产气荚膜梭菌肠毒素cpe的引物序列为：上游引物cpe01：5’‑AGTGTAAATTAAGCTTTTGAGTCCA‑3’，下游引物cpe02：5’‑TAGCTGCTGCTACAGAAAGATTAA‑3’，荧光探针cpep为5’‑AAGGGTATGAGTTAGAAGAACGCCAATCA‑3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ‑1。...

【技术特征摘要】
1.产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)荧光定量反应液、b)产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品、c)阴性质控品；其中荧光定量反应液包含有引物2对和探针1对，为产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02以及荧光探针cpap；产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02以及荧光探针cpep，其中，产气荚膜梭菌外毒素cpa的引物序列为：上游引物cpa01：5’-GATTTGTAAGGCGCTTATTTGT-3’，下游引物cpa02：5’-ATAGCATGAGTTCCTGTTCCA-3’，荧光探针cpap：5’-CTACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTG-3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是TAMRA，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-2；产气荚膜梭菌肠毒素cpe的引物序列为：上游引物cpe01：5’-AGTGTAAATTAAGCTTTTGAGTCCA-3’，下游引物cpe02：5’-TAGCTGCTGCTACAGAAAGATTAA-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蓉蓉，艾地云，张腾飞，罗青平，邵华斌，温国元，王红琳，汪宏才，罗玲，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42