【技术实现步骤摘要】
产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法
本专利技术涉及一种检测产气荚膜梭菌α毒素的单克隆抗体阻断ELISA方法。
技术介绍
产气荚膜梭菌是人、畜消化道的正常菌群,是引起人的创伤性气性坏疽、食物中毒、坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原。在家禽中,主要引起坏死性肠炎而危害养禽业。在家畜中,主要引起牛羊“猝死症”、羔羊痢疾、牛的肠毒血症及绵羊软肾病。α毒素(CPA)是几乎所有类型产气荚膜梭菌都能产生的一种多功能性金属酶,是典型的致死性毒素,因此α毒素是诊断产气荚膜梭菌病的重要依据,是判定食品安全的重要指标。检测α毒素的经典方法包括毒素中和试验、动物试验、卵磷脂分解试验等,但操作步骤较繁琐、敏感性不高。随着国外生物技术的快速发展,近年来对α毒素的检测方法已有很大进展,Naylor等建立了多抗基础上的ELISA检测方法,McCourt等用双夹心ELISA检测α毒素,Hale等建立了捕获抗体ELISA方法。但是这些方法在国内可操作性欠缺,灵敏度亦不是特别高,而国外可购买的检测试剂盒价格高昂,无法定量和大批量检测,在国内推广可能性较低,因此为了填补国内α毒素检测的空白,需要建立一种快速、灵敏、特异并能定量和大批量检测的ELISA方法。
技术实现思路
基于以上不足之处,本专利技术提供了一种产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法,用于α毒素的早期检测,为产气荚膜梭菌的早期诊断、传播预防、后续研究提供有效检测工具。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法,包括如下步骤:一、单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建 ...
【技术保护点】
一种产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法,其特征在于所述检测方法步骤如下:一、单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立:(1)用包被液将α毒素重组蛋白稀释至5μg/mL,100μL/孔包被96孔酶标板,4℃过夜;(2)用PBST溶液洗涤3次,加入含5%脱脂奶粉的PBS溶液作为封闭液200μL/孔,37℃孵育2h;(3)用PBST溶液洗涤3次后加入待检样品,同时设置阴阳性对照,阳性对照为α毒素多克隆抗体,阴性对照为阴性血清,100μL/孔,37℃孵育1h;(4)3次PBST溶液洗涤后,将杂交瘤细胞株A10E5制备的单克隆抗体纯化腹水用PBS缓冲液稀释至2.5μg/mL,100μL/孔,37℃反应1h;(5)用PBST溶液洗涤3次,加入用PBS缓冲液1∶5000体积比稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育1h,PBST溶液洗涤3次;(6)最后加入显色液100μL/孔,室温条件避光反应10min,用2M H2SO4溶液终止反应,490nm处读取吸光值;二、结果判定标准的确定:计算CP阴性样品平均值与标准差(S),求得为阳性临界值,为阴性临界值;当样品阻断率则血清样品判为阳性; ...
【技术特征摘要】
1.一种产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法,其特征在于所述检测方法步骤如下:一、单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立:(1)用包被液将α毒素重组蛋白稀释至5μg/mL,100μL/孔包被96孔酶标板,4℃过夜;(2)用PBST溶液洗涤3次,加入含5%脱脂奶粉的PBS溶液作为封闭液200μL/孔,37℃孵育2h;(3)用PBST溶液洗涤3次后加入待检样品,同时设置阴阳性对照,阳性对照为α毒素多克隆抗体,阴性对照为阴性血清,100μL/孔,37℃孵育1h,所述α毒素多克隆抗体的制备步骤如下:选取2-3Kg新西兰大白兔,首免为纯化的重组α毒素与等体积弗式完全佐剂完全乳化后背部皮下多点注射,剂量为2mg/只,首免两周后用弗式不完全佐剂与等体积纯化的重组α毒素完全乳化,剂量为1mg/只,每周免疫一次,3免后1周用不加佐剂的纯化的重组α毒素加强免疫,7d后兔心脏采血获得血清,得到抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体;(4)3次PBST溶液洗涤后,将杂交瘤细胞株A10E5制备的单克隆抗体纯化腹水用PBS缓冲液稀释至2.5μg/mL,100μL/孔,37℃反应1h,所述杂交瘤细胞株A10E5制备的单克隆抗体纯化腹水是按以下方法获得的:a、抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备:选择与骨髓瘤细胞SP2/0同源的纯系雌性BALB/c小鼠作为免疫动物,免疫方案:以切胶纯化和复性后α毒素重组蛋白为免疫原制备单克隆抗体,首次免疫时取50μg纯化蛋白与等体积完全弗氏佐剂进行乳化,采用腹腔注射方式对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫;3周后取50μg纯化蛋白与等体积不完全弗氏佐剂乳化进行第二次免疫;此后每隔2周进行一次免疫,免疫剂量和免疫途径与第二次免疫相同,最后一次免疫后3-5天取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合;b、取生长状态良好骨髓瘤细胞SP2/0与上述ELISA检测效价最高小鼠脾细胞利用PEG3350进行化学法融合,运用间...
【专利技术属性】
技术研发人员:李广兴,乔艺然,张艳,郑晓星,任玉东,
申请(专利权)人:东北农业大学,
类型:发明
国别省市:黑龙江;23
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