产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法技术

技术编号:11297863 阅读:179 留言:0更新日期:2015-04-15 14:32
本发明专利技术公开了一种产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法,用于α毒素的早期检测,为产气荚膜梭菌的早期诊断、传播预防、后续研究提供有效检测工具。所述方法包括以下两个步骤:一、单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立;二、结果判定标准的确定。本发明专利技术首次建立了特异性好、灵敏度高、稳定性好,快速、简便,高效检测α毒素的单克隆抗体阻断ELISA检测方法,该方法操作简单、检测速度快、可定量检测和大批量检测。总之,该单克隆抗体阻断ELISA有望在产气荚膜梭菌病的防治中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】
产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法
本专利技术涉及一种检测产气荚膜梭菌α毒素的单克隆抗体阻断ELISA方法。
技术介绍
产气荚膜梭菌是人、畜消化道的正常菌群,是引起人的创伤性气性坏疽、食物中毒、坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原。在家禽中,主要引起坏死性肠炎而危害养禽业。在家畜中,主要引起牛羊“猝死症”、羔羊痢疾、牛的肠毒血症及绵羊软肾病。α毒素(CPA)是几乎所有类型产气荚膜梭菌都能产生的一种多功能性金属酶,是典型的致死性毒素,因此α毒素是诊断产气荚膜梭菌病的重要依据,是判定食品安全的重要指标。检测α毒素的经典方法包括毒素中和试验、动物试验、卵磷脂分解试验等,但操作步骤较繁琐、敏感性不高。随着国外生物技术的快速发展,近年来对α毒素的检测方法已有很大进展,Naylor等建立了多抗基础上的ELISA检测方法,McCourt等用双夹心ELISA检测α毒素,Hale等建立了捕获抗体ELISA方法。但是这些方法在国内可操作性欠缺,灵敏度亦不是特别高,而国外可购买的检测试剂盒价格高昂,无法定量和大批量检测,在国内推广可能性较低,因此为了填补国内α毒素检测的空白,需要建立一种快速、灵敏、特异并能定量和大批量检测的ELISA方法。
技术实现思路
基于以上不足之处,本专利技术提供了一种产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法,用于α毒素的早期检测,为产气荚膜梭菌的早期诊断、传播预防、后续研究提供有效检测工具。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法,包括如下步骤:一、单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立:(1)用包被液将α毒素重组蛋白稀释至5μg/mL。100μL/孔包被96孔酶标板,4℃过夜。本步骤中,所述包被液为0.05mol/L碳酸盐包被缓冲液,其配制方法如下:称取Na2CO31.5g、NaHCO32.93g,调节pH至9.6,加蒸馏水至1000mL,4℃保存。(2)用PBST溶液洗涤3次,加入含5%脱脂奶粉的PBS溶液作为封闭液200μL/孔,37℃孵育2h。本步骤中,所述PBST溶液为含0.05%Tween-20的PBS溶液,其配制方法为:称取NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58g、KH2PO40.27g,加蒸馏水至1000mL,调至pH7.4(此步配成溶液即为PBS);再加入0.5mLTween-20。本步骤中,所述含5%脱脂奶粉的PBS溶液的配制方法为:每100mlPBS溶液中加5g脱脂奶粉。(3)用PBST溶液洗涤3次后加入待检样品,同时设置阴阳性对照,阳性对照为α毒素多克隆抗体,阴性对照为阴性血清,100μL/孔,37℃孵育1h。本步骤中,所述α毒素多克隆抗体的制备步骤如下:选取2-3Kg新西兰大白兔,首免为纯化的重组α毒素与等体积弗式完全佐剂完全乳化后背部皮下多点注射,剂量为2mg/只,首免两周后用弗式不完全佐剂与等体积纯化的重组α毒素完全乳化,剂量为1mg/只,每周免疫一次,3免后1周用不加佐剂的纯化的重组α毒素加强免疫,7d后兔心脏采血获得血清,得到抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体,通过间接ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹法用于多抗特性鉴定。(4)3次PBST溶液洗涤后,将杂交瘤细胞株A10E5制备的单克隆抗体纯化腹水用PBS缓冲液稀释至2.5μg/mL,100μL/孔,37℃反应1h。本步骤中,所述杂交瘤细胞株A10E5制备的单克隆抗体纯化腹水是按以下方法获得的:a、抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备:选择与骨髓瘤细胞SP2/0同源的纯系雌性BALB/c小鼠(4-6周龄)作为免疫动物,免疫方案:以切胶纯化和复性后α毒素重组蛋白为免疫原制备单克隆抗体。首次免疫时取50μg纯化蛋白与等体积完全弗氏佐剂进行乳化,采用腹腔注射方式对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫;3周后取50μg纯化蛋白与等体积不完全弗氏佐剂乳化进行第二次免疫;此后每隔2周进行一次免疫,免疫剂量和免疫途径与第二次免疫相同,最后一次免疫后3-5天取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合。b、取生长状态良好骨髓瘤细胞SP2/0与上述ELISA检测效价最高小鼠脾细胞利用PEG3350进行化学法融合,运用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,并采用有限稀释法进行3-5次亚克隆,得到抗产气荚膜梭菌α毒素杂交瘤细胞株A10E5;利用A10E5单克隆抗体杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水,纯化后-70℃保存备用。(5)用PBST溶液洗涤3次,加入用PBS缓冲液1∶5000体积比稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育1h,PBST溶液洗涤3次。(6)最后加入显色液100μL/孔,室温条件避光反应10min,用2MH2SO4溶液终止反应,490nm处读取吸光值。二、结果判定标准的确定:计算CP阴性样品平均值与标准差(S),求得为阳性临界值,为阴性临界值。样品阻断率则血清样品判为阳性;当时为阴性;对于在介于两者之间的血清样品,判定为可疑,需要重复检测一次,如仍可疑则判定为阳性。相比于现有技术,本专利技术具有如下的优点:(1)特异性强:利用已建立的阻断ELISA检测方法对实验室保存的其他病原阳性血清进行检测。结果显示,只有产气荚膜梭菌阳性血清检测为阳性,其他血清均为阴性,说明本专利技术建立的检测体系特异性良好,无交叉反应。(2)灵敏度高:用建立的阻断ELISA检测方法对倍比稀释的α毒素阳性多抗进行检测,结果表明该阻断ELISA检测方法最低可以检测到0.0125mg/mL的抗体,即为此方法最低检测线。(3)重复性好:对3个不同批次制备的兔抗产气荚膜梭菌梭菌α毒素多抗血清在板内和板间进行重复性试验。板内重复性试验是在同一块酶标板内对每个样品设置4个复孔进行阻断ELISA检测,计算其变异系数在2.080-2.819%之间;板间重复试验是在4块不同的酶标板进行阻断ELISA检测每个样品,计算其变异系数在1.735-2.975%。这两个重复性试验的变异系数都小于10%,证明本专利技术建立的阻断ELISA检测方法具有良好的重复性。(4)本专利技术首次建立了特异性好、灵敏度高、稳定性好,快速、简便,高效检测α毒素的单克隆抗体阻断ELISA检测方法,该方法操作简单、检测速度快、可定量检测和大批量检测。总之,该单克隆抗体阻断ELISA有望在产气荚膜梭菌病的防治中发挥重要作用。附图说明图1是产气荚膜梭菌α毒素基因PCR图,其中,M:DNAmarker;1:α毒素基因扩增结果;图2是最佳抗原包被浓度的选择;图3是抗原包被时间的选择;图4是最佳封闭液的选择;图5是最佳封闭时间的选择;图6是最佳待检样品孵育时间的选择;图7是最佳单抗孵育时间的选择;图8是最佳酶标抗体稀释浓度的选择;图9是最佳酶标抗体孵育时间的选择;图10是最佳显色液作用时间的选择;图11是单克隆抗体阻断ELISA特异性试验。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围,均应涵盖在本专利技术的保护范围中。实施例1产气荚膜梭菌α毒素的原核表达:根据GenBank已发表的产气荚膜梭菌α毒素基因序列(登录号CP000246.本文档来自技高网...
产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法

【技术保护点】
一种产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法,其特征在于所述检测方法步骤如下:一、单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立:(1)用包被液将α毒素重组蛋白稀释至5μg/mL,100μL/孔包被96孔酶标板,4℃过夜;(2)用PBST溶液洗涤3次,加入含5%脱脂奶粉的PBS溶液作为封闭液200μL/孔,37℃孵育2h;(3)用PBST溶液洗涤3次后加入待检样品,同时设置阴阳性对照,阳性对照为α毒素多克隆抗体,阴性对照为阴性血清,100μL/孔,37℃孵育1h;(4)3次PBST溶液洗涤后,将杂交瘤细胞株A10E5制备的单克隆抗体纯化腹水用PBS缓冲液稀释至2.5μg/mL,100μL/孔,37℃反应1h;(5)用PBST溶液洗涤3次,加入用PBS缓冲液1∶5000体积比稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育1h,PBST溶液洗涤3次;(6)最后加入显色液100μL/孔,室温条件避光反应10min,用2M H2SO4溶液终止反应,490nm处读取吸光值;二、结果判定标准的确定:计算CP阴性样品平均值与标准差(S),求得为阳性临界值,为阴性临界值;当样品阻断率则血清样品判为阳性;当时为阴性;对于在介于两者之间的血清样品,判定为可疑,需要重复检测一次,如仍可疑则判定为阳性。...

【技术特征摘要】
1.一种产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法,其特征在于所述检测方法步骤如下:一、单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立:(1)用包被液将α毒素重组蛋白稀释至5μg/mL,100μL/孔包被96孔酶标板,4℃过夜;(2)用PBST溶液洗涤3次,加入含5%脱脂奶粉的PBS溶液作为封闭液200μL/孔,37℃孵育2h;(3)用PBST溶液洗涤3次后加入待检样品,同时设置阴阳性对照,阳性对照为α毒素多克隆抗体,阴性对照为阴性血清,100μL/孔,37℃孵育1h,所述α毒素多克隆抗体的制备步骤如下:选取2-3Kg新西兰大白兔,首免为纯化的重组α毒素与等体积弗式完全佐剂完全乳化后背部皮下多点注射,剂量为2mg/只,首免两周后用弗式不完全佐剂与等体积纯化的重组α毒素完全乳化,剂量为1mg/只,每周免疫一次,3免后1周用不加佐剂的纯化的重组α毒素加强免疫,7d后兔心脏采血获得血清,得到抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体;(4)3次PBST溶液洗涤后,将杂交瘤细胞株A10E5制备的单克隆抗体纯化腹水用PBS缓冲液稀释至2.5μg/mL,100μL/孔,37℃反应1h,所述杂交瘤细胞株A10E5制备的单克隆抗体纯化腹水是按以下方法获得的:a、抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备:选择与骨髓瘤细胞SP2/0同源的纯系雌性BALB/c小鼠作为免疫动物,免疫方案:以切胶纯化和复性后α毒素重组蛋白为免疫原制备单克隆抗体,首次免疫时取50μg纯化蛋白与等体积完全弗氏佐剂进行乳化,采用腹腔注射方式对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫;3周后取50μg纯化蛋白与等体积不完全弗氏佐剂乳化进行第二次免疫;此后每隔2周进行一次免疫,免疫剂量和免疫途径与第二次免疫相同,最后一次免疫后3-5天取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合;b、取生长状态良好骨髓瘤细胞SP2/0与上述ELISA检测效价最高小鼠脾细胞利用PEG3350进行化学法融合,运用间...

【专利技术属性】
技术研发人员:李广兴乔艺然张艳郑晓星任玉东
申请(专利权)人:东北农业大学
类型:发明
国别省市:黑龙江;23

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