血样中微量伊马替尼测定方法及在零期临床试验中的应用技术

本发明专利技术涉及血样中微量伊马替尼测定方法及在零期临床试验中的应用。具体地说，本发明专利技术一个方面涉及一种测定生物样品中伊马替尼或其药用盐的方法，该方法使用高效液相色谱-串联质谱进行测定，并且包括以下步骤和测试条件：测试样品的处理、试样测定、液相色谱条件、质谱条件等。本发明专利技术还涉及本发明专利技术方法在伊马替尼或其药用盐的零期临床试验中的应用；以及本发明专利技术方法在伊马替尼或其药用盐的药代动力学试验研究中的应用。已经发现，具有本发明专利技术特征的检测方法可以有益地用于检测伊马替尼或其药用盐例如甲磺酸盐在其药物零期临床试验中生物样品例如血浆中的浓度测定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药
，涉及一种药物的测定方法，特别涉及一种生物样品例如血浆中的药物的测定方法，更特别地涉及一种针对生物样品例如血浆中极微量的抗癌药物伊马替尼及其药用盐的测定方法。本专利技术还涉及该方法在药物零期临床试验研究中的应用。
技术介绍
甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate)是瑞士诺华公司开发的一种选择性酪氨酸激酶抑制剂，属苯胺喹唑啉类化合物，其是针对P210蛋白的酪氨酸激酶活性的选择性抑制剂，靶向抑制Ph染色体阳性(Philadelphia chromosome positive，Ph+)慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukaemia,CML)产生的具有酪氨酸激酶活性的异常蛋白Bcr-Abl。FDA已于2001年5月批准用于治疗慢性骨髓性白血病，2002年2月FDA进一步批准甲磺酸伊马替尼用于胃肠基质肿瘤的治疗。甲磺酸伊马替尼在体内外均可在细胞水平上抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶，能选择性抑制Bcr-Abl阳性细胞系细胞、Ph染色体阳性的慢性粒细胞白血病和急性淋巴细胞白血病病人的新鲜细胞的增殖和诱导其凋亡。此外，甲磺酸伊马替尼还可抑制血小板衍化生长因子(PDGF)受体、干细胞因子(SCF)，c-Kit受体的酪氨酸激酶，从而抑制由PDGF和SCF介导的细胞行为。其化学名为：4-[(4-甲基-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]-苯胺甲磺酸盐，分子式为C29H31N7O-CH4SO3，分子量为589.7。甲磺酸伊马替尼的化学结构如下所示：r>甲磺酸伊马替尼为白色—类白色到浅褐色或浅黄色色调的结晶粉末。甲磺酸伊马替尼可溶于≤pH5.5的水性缓冲液中，而在中性到碱性的水性缓冲液中微溶到不溶。在非水溶剂中，甲磺酸伊马替尼自由溶解到极微溶于二甲亚砜、甲醇和乙醇，但是不溶于正辛醇、丙酮和乙腈。甲磺酸伊马替尼在商业上可以商品名为的薄膜包衣片获得，它由Novartis Pharma Stein AG(Stein，Switzerland)制备，Novartis Pharmaceuticals Corporation(East Hanover,New Jersey)销售。片片包含的活性成分以伊马替尼游离碱计为100mg或400mg。甲磺酸伊马替尼适用于治疗费城染色体阳性慢性髓细胞性白血病(CML)和Kit(CD 117)阳性不可切除 的和/或转移性恶性胃肠道间质瘤(GIST)。通常给慢性相CML的成年患者处方400mg/天的剂量及给加速相或突发危象的成年患者处方600mg/天的剂量。另外为患有不可切除的和/或转移性恶性GIST的成年患者推荐400mg/天或600mg/天剂量的。通常口服给药，用饭和一大杯水服用，剂量为400mg或600mg，每天一次，及以400mg每天两次共给予800mg剂量。关于零期临床试验的概念。传统的临床研究常由动物数据推测药物在人体进行临床试验的起始剂量，但人和动物间代谢酶种类及数量、代谢途径等均不同，药物在动物体内的吸收、分布、代谢及分泌与人体有很大差异，因此，这种简单的推断往往使临床试验，尤其对于创新药物的临床试验风险增加。2006年英国TNG1412造成的灾难性事件，为我们敲响了警钟。零期临床试验是指活性化合物在完成临床前试验后未正式进入临床试验之前，研制者使用微剂量在少量健康志愿者或者病人(通常为6～15人)进行的药物试验，收集必要的有关药物安全及药代动力学的试验数据，以评估研发药物是否具有进一步开发为新药或生物制剂的可能性，是从临床前试验过渡到I期临床试验的中间环节。进行零期临床试验的目的在于，通过对化合物或剂型进行研究，获得包含蛋白结合率、酶抑制率等的人体药动学数据和包含与靶点的结合情况相关的药效动力学数据，以及采用各种影像学研究手段获得的人体组织分布情况，以便早期从一组候选化合物中确定最有研发价值的先导化合物进行I期临床试验及后续的研发。另外。尽早了解先导化合物在人体的代谢特征。对于非临床安全性研究的动物选择、提高动物试验结果的预测价值也非常有意义。关于零期临床试验的研究方法。零期临床试验的研究方法主要包括微剂量研究(micro-dose studies)和药理学相关剂量研究(pharmacologically relevant dose)。微剂量研究在人体进行的探索性药物研究，是使用低于1/100动物实验数据的剂量值计算人体产生药理效果的剂量，目的是了解受试药品在人体药代动力学特点、评价其在人体的生物学分布及靶向效果、测定其剂量范围和给药次数及顺序、明确两种以上药物衍生物状态下的药代和药效，同时对开发新型的显影探针或显影技术有很大帮助。美国FDA和欧洲EMEA对微剂量的定义是：低于通过临床前毒理学研究获得的动物安全性数据而推导出的拟用于人体可能产生临床药理学效应剂量的1/100，且最大剂量不超过100μg的剂量。对于蛋白类产品，剂量需≤30nmol。药理学相关剂量研究在动物体内进行的探索性药物研究，属临床前研究的范畴，其目的在于评价受试药品的药理作用，进行试验前应有临床前安全数据(敏感物种2周毒理学实验结果)。药理学相关剂量研究通常连续用药不超过7d，起始剂量为敏感物种1/50的NOAEL(未观察到的副作用剂量，mg/m2)，最大剂量为1/4或1/2的NOAEL或出现靶指标的变化或副作用。药理学相关剂量研究不仅对了解受试药品在人体的作用机制有极大的帮助，还能够在I期试验之前提供人体内药代-药效相关数据，为确定采用单制剂或混合制剂、评价作用于同一靶向的两种以上药物及衍生物的人体内药效提供了参考。对进一步研发选择有希望的先导化合物提供科学依据。关于零期临床试验与传统的I期临床试验的区别。由于试验目的不同，零期临床试验与传统的I期临床试验在受试者人数、受试时间、受试药物剂量、受益评估等方面存在很大区别，详见表1。表1：零期临床试验与传统的I期临床试验的区别上表中，*指肿瘤药物关于零期临床试验的检测方法。由于0期临床试验是微剂量试验，因此需要有超灵敏和精确的检测手 段来实现对药物及其代谢产物浓度的测定、药物与特定受体或酶的结合情况，以确定药物PK/PD的特征、提供药物与其靶点作用的信息、评定药物的作用机制、通过对药物生物分布的研究提供药物初步的安全性和有效性的信息等，目前应用的主要分析方法有：(1)定量分析方法：主要包括加速器质谱仪测定法(zccelerator mass spectrometry，AMS)、高效液相色谱串联质谱仪测定法(liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC/MS/MS)和电感耦合等离子体光学发射光谱仪测定法(inductively coupled plasma-opticemission spectrometer，ICP-OES)；(2)半定量分析方法：主要包括正电子发射计算机断层显像仪(positron em本文档来自技高网...

【技术保护点】
测定生物样品中伊马替尼或其药用盐的方法，该方法使用高效液相色谱‑串联质谱进行测定，并且包括以下步骤和测试条件：(1)测试样品的处理：取100μL含药生物样品于1.5mL管中，加20μL甲醇，加入20μL内标溶液(300ng/mL)，涡旋混匀，加入100μL甲醇和200mL乙腈，涡旋50秒，于4℃14000rpm离心5min，取上清液200μl转移至1.5mL进样瓶中，作为测试样品待检测；(2)试样测定：取20μL测试样品注入高效液相色谱‑串联质谱仪中，检测样品中的伊马替尼和内标的色谱峰，并据此计算所述生物样品中的伊马替尼的浓度；(3)液相色谱条件：色谱柱：Phenomene C18 100A柱(3.0×50mm)；流动相：乙腈(含0.1％甲酸)：水(含2mmol/L乙酸铵和0.1％甲酸)，梯度洗脱(5：95，1min；90：10，3.5min；90：10，4min；5：95，4.1min；5：95，6min)，流速：0.4mL/min，进样量：20μL；(4)质谱条件：离子源：离子喷雾离子化源；离子喷射电压：5500V；温度：550℃；源内气体1(GS1，N2)压力：50psi；源内气体2(GS2，N2)压力：50psi；气帘气体(N2)压力：20psi；正离子方式检测；扫描方式：选择离子反应监测(MRM)方式；用于定量分析的离子反应分别为m/z494.3→m/z394.1(伊马替尼)和m/z 408.2→m/z235.0(MK0431，内标)。...

【技术特征摘要】
1.测定生物样品中伊马替尼或其药用盐的方法，该方法使用高效液相色谱-串联质谱进行测定，并且
包括以下步骤和测试条件：
(1)测试样品的处理：
取100μL含药生物样品于1.5mL管中，加20μL甲醇，加入20μL内标溶液(300ng/mL)，涡旋混匀，加
入100μL甲醇和200mL乙腈，涡旋50秒，于4℃14000rpm离心5min，取上清液200μl转移至1.5mL进样
瓶中，作为测试样品待检测；
(2)试样测定：
取20μL测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中的伊马替尼和内标的色谱峰，并据此
计算所述生物样品中的伊马替尼的浓度；
(3)液相色谱条件：
色谱柱：Phenomene C18 100A柱(3.0×50mm)；流动相：乙腈(含0.1％甲酸)：水(含2mmol/L乙酸铵和
0.1％甲酸)，梯度洗脱(5：95，1min；90：10，3.5min；90：10，4min；5：95，4.1min；5：95，6min)，流
速：0.4mL/min，进样量：20μL；
(4)质谱条件：
离子源：离子喷雾离子化源；离子喷射电压：5500V；温度：550℃；源内气体1(GS1，N2)压力：50psi；
源内气体2(GS2，N2)压力：50psi；气帘气体(N2)压力：20psi；正离子方式检测；扫描方式：选择离子反
应监测(MRM)方式；用于定量分析的离子反应分别为m/z494.3→m/z394.1(伊马替尼)和m/z 408.2→m/z
235.0(MK0431，内标)。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于以下任一项或多项：
所述伊马替尼的药用盐选自甲磺酸伊马替尼、盐酸伊马替尼、磷酸伊马替尼、甲苯磺酸伊马替尼；
所述生物样品选自血浆、尿液、唾液等；
所述含药生物样品中包含的伊马替尼的浓度低于100ng/ml，例如低于75ng/ml，例如低于50ng/ml；
所述高效液相色谱-串联质谱能够检测到的含药生物样品中的伊马替尼的浓度高于0.1ng/ml，例如高于
0.2ng/ml，例如高于0.3ng/ml，例如高于0.4ng/ml；
所述内标是西格列汀。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于以下任一项或多项：
所述“(1)测试样品的处理”中，所添中的20μL甲醇中包含有机酸；
所述有机酸选自酒石酸、枸橼酸、马来酸、苹果酸、富马酸；
所述有机酸在甲醇中的浓度为20～200ug/ml，例如25～150ug/ml，例如50～100ug/ml；
所述“(2)试样测定”中，计算所述生物样品中的伊马替尼的浓度是采用内标标准曲线法进行计算的。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于以下任一项或多项：
所述内标标准曲线法还包括建立标准曲线的步骤；
所述建立标准曲线包括以下步骤：
取100μL不含药的空白生物样品8份，分别置于1.5mL管中，各管分别添加20μL甲醇，分别加入20μL
内标溶液(300ng/mL)，以贮备液的形式分别添加伊马替尼或其药用盐以伊马替尼计0.04ng、0.1ng、0.2ng、
0.5ng、1ng、2ng、3ng、4ng，将各管涡旋混匀，分别加入100μL甲醇和200mL乙腈，涡旋50秒，于4℃14000rpm
离心5min，取上清液200μl转移至1.5mL进样瓶中，作为8...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兴河，周保利，陈刚，王进，漆璐，王泽娟，金辉，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京世纪坛医院，
类型：发明
国别省市：北京;11