本发明专利技术提供一类多芳基取代咪唑荧光探针的制备方法及其在检测G-四链体核酸中的应用。该类探针制备简单、易得，并且结构稳定，可用于特异性检测G-四链体核酸二级结构，通过荧光分光光度计可以快速检测出溶液中的DNA样品的二级结构。该类探针对G-四链体核酸二级结构的检测方法具有操作简便，选择性好的优点，并且克服了其他检测方法价格昂贵，设备要求高，技术操作相对复杂等缺点。
【技术实现步骤摘要】
一种多芳基取代咪唑荧光探针及其制备方法和在检测G-四链体结构中的应用
本专利技术涉及一种荧光探针，更具体地，涉及一种多芳基取代咪唑荧光探针及其制备方法和在检测G-四链体结构中的应用。
技术介绍
G-四链体（G-quadruplex）是一种特殊的DNA二级结构。人类基因组中很多富鸟嘌呤区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动子区域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰岛素基因等。G-四链体结构具有多态性，链的数量和取向、loop的连接方式以及鸟嘌呤的糖苷扭转角以及与羰基负电中心配位的金属离子等多方面决定了G-四链体的类型和构象，这些差异性也为蛋白和小分子化合物提供了多个识别位点。根据链的取向不同，G-四链体分为正平行，反平行与混合型三种构象。G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用。研究证明，某些启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。所以，在体内或者体外试验中，能够特异性地检测出G-四链体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。目前，在体内和体外检测G-四链体结构的研究都取得了一些进展。由于体内大大过量的双螺旋DNA的存在，以及复杂的细胞内环境，使得体内的检测相对于体外检测需要解决更多的难题，目前已有一些荧光分子可以实现体内G-四链体结构的检测。申请人实验室前期的工作中合成了一系列的三芳基取代咪唑类的化合物，其对G-四链体具有较好的选择性和结合能力。申请人将多种荧光团结构融合到三芳基咪唑结构当中，得到了新型的G-四链体探针，该探针选择性识别G-四链体，有些可以进一步识别正平行G-四链体。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种荧光探针，所述的荧光探针的结构式为：n为2，3，4或5；R1为O或N；R2为O或N；R3为甲氧基，氨基，甲胺，二甲胺，二乙胺，吗啡啉，哌啶，N-甲基哌嗪，羧基，羟基，甲酰胺，苯甲酸，1-甲基咪唑，双氯乙基甲胺，糖基或核酸碱基；R4为甲氧基，氨基，甲胺，二甲胺，二乙胺，吗啡啉，哌啶，N-甲基哌嗪，羧基，羟基，甲酰胺，苯甲酸，1-甲基咪唑，双氯乙基甲胺，糖基或核酸碱基。所述的R1和R3也可以通过三氮唑连接，所述的R2和R4也可以通过三氮唑连接。更具需求，再提供一种荧光探针，所述的荧光探针的结构式为所述的R5和R6为F、-O-CH3、、、、、、、、、、或。所述的R5和R6也可以同时为F或-O-CH3，也可以不同时为F或-O-CH3。所述的荧光团为7-二乙胺基香豆素，1,8-萘酰亚胺，氟硼二吡咯，荧光素，罗丹明，咔唑或二苯乙烯。更进一步的提供一种上述的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：步骤1.制备获得荧光团，并引入醛基；步骤2.在或上引入相关的官能团获得或；步骤3.将步骤1所述制得的荧光团和步骤2所述的或反应，即得。更进一步的提供上述的荧光探针在制备检测G-四链体结构的药物中的应用。为了更好地理解本专利技术，以下对本专利技术方案结合反应式作进一步的阐释，所列的反应式仅为理论推导所得，其不能作为本专利技术保护范围的限制。本专利技术同时提供了上述探针的制备方法。用S2代表相关的荧光团。以香豆素荧光团为例，表示如下：具体步骤为：先用4-二乙胺基水杨醛与丙二酸二乙酯反应，得到化合物S1，再将S1在POCl3的存在下与DMF反应，得到醛基香豆素中间体S2；将原料脱甲基得到S3；在这基础上，通过取代反应引入不同长度的官能团侧链或者通过点击反应引入官能团侧链得到S4，将S4与中间体S2反应，得到最终探针化合物S5。代表性化合物5a及5b结构如下：以氟硼二吡咯荧光团为例，表示如下：具体步骤为：先用对苯二甲醛与2,4-二甲基吡咯反应，得到化合物，再将其用氧化剂DDQ氧化得到化合物S1，三氟化硼配位，然后水解得到荧光团中间体S2；将原料脱甲基得到S3；在这基础上，通过取代反应引入不同长度的官能团侧链或者通过点击反应引入官能团侧链得到S4，将S4与中间体S2反应，得到最终探针化合物S5。代表性化合物5c：以咔唑荧光团为例，表示如下：具体步骤为：从原料咔唑出发，通过维斯迈尔反应得得到荧光团中间体S2；在或者基础上，通过取代反应引入不同长度的官能团侧链或者通过点击反应引入官能团侧链得到S4，将S4与中间体S2反应，得到最终探针化合物。代表性化合物：以萘酰亚胺荧光团为例，表示如下：另外，代表性化合物如下：本专利技术提供的探针由于具有较大的电子共轭体系和平面，该类探针分子内的电荷转移效应的强弱可以影响分子的荧光发射强度。当探针分子与某种大分子相互作用后，分子内的可转动的双键的柔性受到限制，使分子内电荷转移效应增强，荧光也有明显增强。同时，该类探针的分子结构的柔性的共轭平面，并且具有可以转动的键，使其可以比较容易堆积在G-四连体的G-四分体的平面上，进而与G-四链体具有较强的作用力，同时与其他二级结构的DNA作用较弱。所以，将该探针与不同二级结构的DNA混合时，当该DNA为G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生荧光光谱的改变。当DNA的二级结构为其他结构时，则不会产生明显的信号变化。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：（1）该类探针制备简单，易得，并且结构稳定，便于储存；（2）本专利技术提供的探针可以特异性地检测识别G-四链体结构，实现了G-四链体结构与其他二级结构的区分，用简单的荧光光谱就可以识别出DNA样品的二级结构，快捷，操作简便，成本低廉，并且可以实现实地检测。而且本专利技术的有些分子能够识别正平行G-四链体。附图说明图1为探针5a滴定分子内正平行构象G-四链体DNA(pu22)的荧光光谱。图2为探针5a滴定不同DNA（包括G4与其他二级结构）的荧光曲线图。图3为探针5aTris-HCl缓冲溶液中滴加不同二级结构的DNA样品，在紫外灯下的荧光变化，探针浓度为1uM，待测样品为10uM。图4为探针5a用于特异性对G-四链体进行染胶。图5为探针5b滴定不同DNA（包括G4与其他二级结构）的荧光曲线图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本专利技术。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、设备和方法为本
常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。以下通过具体的实施例进一步说明本专利技术的技术方案。通过紫外光谱实验证明，本专利技术涉及的化合物由于具有较大的电子共轭体系和平面，该类探针分子内的电荷转移效应的强弱可以影响分子的荧光发射强度。当探针分子与G-四链体相互作用后，分子内的可转动的双键的柔性受到限制，使分子内电荷转移效应增强，荧光也有明显增强。同时，该类探针的分子结构的柔性的共轭平面，并且具有可以转动的键，使其可以比较容易堆积在G-四链体的G-四分体的平面上，进而与G-四链体具有较强的作用力，同时与其他二级结构的DNA作用较弱，使该类探针具有很好的特异性识别作用。所以，我们将该探针与不同二级结构的DNA混合时，当该DNA为G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生荧光光谱的改变。当DNA的二级本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针的结构式为： n 为 2，3，4或5； R1 为 O或N； R2 为 O或N； R3 为 甲氧基，氨基，甲胺，二甲胺，二乙胺，吗啡啉，哌啶，N‑甲基哌嗪，羧基，羟基，甲酰胺，苯甲酸，1‑甲基咪唑，双氯乙基甲胺，糖基或核酸碱基；R4 为 甲氧基，氨基，甲胺，二甲胺，二乙胺，吗啡啉，哌啶，N‑甲基哌嗪，羧基，羟基，甲酰胺，苯甲酸，1‑甲基咪唑，双氯乙基甲胺，糖基或核酸碱基。
【技术特征摘要】
1.一种荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针的结构式为所述的R5和R6为F、-O-CH3、、、、、、、、、、或；所述的荧光团为7-二乙胺基香豆素，1,8-萘酰亚胺，氟硼二吡咯，荧光素，罗丹明，咔唑或二苯乙烯；当荧光团为7-二乙胺基香豆素，且当R5为F时，R6不同时为N-甲基哌嗪基；当荧光团为7-二乙胺基香豆素，当R5为N-甲基哌嗪基时，R6不同时为N...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄志纾，谭嘉恒，胡命豪，陈硕斌，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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