一种特异识别异质性核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)的寡核苷酸适配体C6‑8的序列和应用制造技术

本发明专利技术公开了属于分子生物医学技术领域的一种特异识别异质性核糖核蛋白A2／B1(hnRNPA2／B1)的寡核苷酸适配体C6‑8的序列和应用。通过针对多种肿瘤细胞的SELEX技术获得了单链DNA寡核苷酸适配体C6‑8，标记FITC后，经荧光染色证明该适配体能够特异识别多种上皮源性的肿瘤细胞株和临床肝癌病理切片中的癌细胞。因此，C6‑8序列在肿瘤研究领域、临床肿瘤组织切片标本的鉴别、肿瘤生物导向治疗领域具有广泛应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种特异识别异质性核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)的寡核苷酸适配体C6-8的序列和应用专利
：本专利技术涉及特异识别hnRNPA2/B1蛋白的寡核苷酸适配体C6-8的序列和修饰，以及修饰后的C6-8在识别表达hnRNPA2/B1蛋白的多种肿瘤细胞方面的应用。本专利技术涉及C6-8在生物医药方面的应用，C6-8作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于临床肿瘤组织切片标本的辅助诊断、肿瘤生物导向治疗。
技术介绍
：目前，应用特异性抗体检测相关标志物的的免疫组织化学或免疫荧光方法还是临床病理诊断的“金标准”。就上皮源性的肿瘤而言，已有多种标志物抗体在临床应用。如角蛋白(Keratin，Ker)、细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)、上皮细胞膜抗原(epithelialmembraneantigen，EMA)及癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)等都是重要的肿瘤相关抗原，广泛存在于各种上皮性肿瘤，多种类型的糖蛋白类肿瘤相关抗原(carbohydrateantigen，CA)也相继被发现在上皮性肿瘤组织中表达增加，如80％以上的人体腺癌可在其细胞膜上检出CA72-4，而非上皮性的恶性肿瘤及良性增殖性病变均无该抗原表达。但总的看来，这些肿瘤相关抗原的特异性和敏感性都不高，临床上常常通过联合检测多种相关抗原来实现对肿瘤患者的临床辅助诊断、预后评价、疗效指导、复发与转移监测等。因此，更多的肿瘤标志物及其抗体亟待发现和制备应用。高通量的生物技术方法为肿瘤标志物的鉴定及其探针的获得提供了便利途径。通常应用蛋白质组学的方法来鉴定新的肿瘤标志物，也有学者应用肿瘤细胞膜成分免疫动物直接获得识别肿瘤细胞的特异性抗体，进而利用抗体鉴定相应靶抗原，即肿瘤标志物。指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyEXponentialEnrichment)技术，是近十几年兴起并迅速得到发展的高通量生物文库筛选技术。应用大容量的随机寡核苷酸文库(ssDNA文库和RNA文库)，结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得的寡核苷酸适配体(aptamer)基于空间结构与靶分子呈高特异性和高亲和力的结合。由于aptamer具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点，又称为“人工替代抗体”，在基础医学、临床诊断与新药研发等方面具有广阔的应用前景。尤其是近年来兴起的复合靶SELEX技术，使得对未知靶分子进行筛选成为可能，并且通过引入消减筛选步骤，能够获得特异识别两组复合靶子中差异存在分子的aptamer，并能利用该适配体反过来对差异靶分子进行研究，这就为开发新型分子探针以及鉴定生物标志物，尤其是肿瘤标志物分子开辟了新的途径。本专利技术是通过以完整细胞为靶子的SELEX技术获得了一个aptamerC6-8。经鉴定，C6-8能够特异识别多种肿瘤细胞株，包括乳腺癌细胞株MCF7、肝癌HepG2细胞，肺癌细胞株H1299，喉癌Hep2，卵巢癌CAOV-3，子宫颈癌HeLa；C6-8还能够特异识别受试的临床肝癌患者的癌组织切片中的异型癌细胞。对照核酸序列与上述细胞及组织均无结合。利用链霉亲和素包被的磁珠和生物素标记的C6-8适配体pμll-down钓取结合的靶蛋白，经生物质谱和EMSA鉴定，证实C6-8所结合的靶蛋白为异质性核糖核蛋白A2／B1(hnRNPA2／B1)。有文献报道，在多种肿瘤组织包括乳腺癌、小细胞肺癌、卵巢癌和结肠癌组织中，可以观察到hnRNPA2／B1蛋白的表达水平升高，而且主要定位于细胞核，因此我们推测hnRNPA2／B1蛋白有可能作为多种肿瘤的特异生物标志物。hnRNPA2／B1蛋白作为一种重要的RNA连接蛋白，是细胞核中异质性细胞核核糖蛋白核心复合体的主要成分。hnRNPA2／B1蛋白可参与mRNA的剪接、核-胞质的转运、转录后调控、染色体稳定性调控等。最近研究表明，hnRNPA2／B1可能在肿瘤发生发展过程中起重要作用。由于C6-8经FITC标记修饰后可直接用于荧光方法检测肿瘤细胞，操作较传统免疫学方法更简单。该专利技术可以在临床医学及基础医学中得到广泛应用。
技术实现思路
：本专利技术目的在于提出特异识别hnRNPA2／B1蛋白的寡核苷酸适配体C6-8的序列及其应用领域，包括在临床肿瘤组织切片标本的辅助鉴别、基础研究以及肿瘤生物导向治疗中的应用。本专利技术通过以下技术方案实现：首先由公司合成C6-8序列，并在5’端或3’端修饰、标记(如FITC、生物素或者地高辛)，然后进行应用研究；组织化学或荧光方法检测C6-8识别hnRNPA2／B1蛋白以及表达该蛋白的多种肿瘤细胞。本专利技术优点：与蛋白类的抗体相比，单链的寡核苷酸更加稳定；aptamer可直接体外合成、标记，因此不需要标记二抗，使得操作更为简单、迅速；aptamer的合成成本较抗体制备成本低，周期短。本专利技术证实C6-8能够特异识别hnRNPA2／B1蛋白以及表达该蛋白的多种肿瘤细胞。因此，C6-8序列在临床医学与基础医学的肿瘤研究相关领域中均具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。附图说明：图1、EMSA实验证实C6-8所结合的靶蛋白为异质性核糖核蛋白A2／B1(hnRNPA2／B1)。图2、C6-8与多种肿瘤细胞特异结合的共聚焦显微镜及流式细胞术测定结果图。图3、C6-8能够特异识别临床上肝癌组织切片上的肿瘤细胞。具体实施方式：下面通过C6-8对多种肿瘤细胞株以及临床肝癌患者组织切片标本中的癌细胞的识别来进一步描述本专利技术。1.合成C6-8序列(序列表中SEQIDNo.1)及对照GP30核酸序列(序列表中SEQIDNo.2)，均在5’端标记Bio和FITC(Invitrogen公司完成)。Bio-C6-8：5’-GTACTTCCATTTGTGTTTGCCCGGAGCCTTAGTCTGTTCAAAAGTGCA-3’FITC-C6-8：5’-GTACTTCCATTTGTGTTTGCCCGGAGCCTTAGTCTGTTCAAAAGTGCA-3’Bio-GP30：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC(N)30CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’FITC-GP30：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC(N)30CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’注：N代表A、T、G、C任意一种。2.C6-8适配体结合靶分子的分离1)分别提取HeLa、H1299、MCF-7、HepG2四种细胞的总蛋白；2)链亲和素包被的磁珠用0.5×PBS洗涤3次后，再用1×PBS洗涤3次；3)分别取600pmolGp30文库和C6-8溶于500μl孵育缓冲液中，与磁珠室温下孵育30min；4)1×PBS洗涤磁珠5次，去除未结合的游离适配体，投入600μg细胞总蛋白提取物与上述磁珠37℃孵育2h；5)1×PBS洗涤磁珠6次，加入50μl1×SDSPAGE上样缓冲液95℃煮10min洗脱结合蛋白；6)取15μl上述洗脱液上样，10％SDS-PAGE电泳，选取特异条带进行质谱鉴定。3.EMSA验证C6-8适配体与靶分子的结合1)分别取1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异识别异质性核糖核蛋白A2／B1(hnRNPA2／B1)的寡核苷酸适配体C6‑8的序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异识别异质性核糖核蛋白A2/B1的寡核苷酸适配体C6-8的序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如序列表中S...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵宁生，李慧，李少华，黄皑雪，丁红梅，李洁，苏雪婷，赵强，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11