本发明专利技术公开了一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法。该方法包括如下步骤：1）根据基因组DNA上的已知序列设计三条方向一致用于扩增侧翼序列的特异性引物，按距离侧翼序列由远及近的顺序将其依次记为GSP1、GSP2和GSP3；2）以基因组DNA为模板，以引物SAP（序列1-15中任一）和所述GSP1进行第一轮PCR扩增，得到PCR产物1；3）以所述PCR产物1为模板，以引物SEP（序列16和17）和所述GSP2进行第二轮PCR扩增，得到PCR产物2；4）以所述PCR产物2为模板，以引物SNP（序列18）和所述GSP3进行第三轮PCR扩增，得到PCR产物3，从而获得所述侧翼序列。本发明专利技术所提供方法具有如下优点：操作简易、高特异性扩增、高成功率、容易得到大的片段、耗时短等。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法。该方法包括如下步骤：1）根据基因组DNA上的已知序列设计三条方向一致用于扩增侧翼序列的特异性引物，按距离侧翼序列由远及近的顺序将其依次记为GSP1、GSP2和GSP3；2）以基因组DNA为模板，以引物SAP（序列1-15中任一）和所述GSP1进行第一轮PCR扩增，得到PCR产物1；3）以所述PCR产物1为模板，以引物SEP（序列16和17）和所述GSP2进行第二轮PCR扩增，得到PCR产物2；4）以所述PCR产物2为模板，以引物SNP（序列18）和所述GSP3进行第三轮PCR扩增，得到PCR产物3，从而获得所述侧翼序列。本专利技术所提供方法具有如下优点：操作简易、高特异性扩增、高成功率、容易得到大的片段、耗时短等。【专利说明】-种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法
本专利技术涉及一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法，特别涉及一种通过 SNM-PCR从基因组DNA中获得侧翼序列的方法。
技术介绍
基因组时代的来临对生物学各领域产生了巨大的影响。对于已完成基因组测序的 少数物种(如人、拟南芥、水稻等)，可直接从数据库中找到已知序列的侧翼序列。然而，自然 界中大多数生物基因组DNA序列仍未知，想要知道一个已知区域两侧的DNA序列，染色体步 移技术是一种非常有效的方法。因此，染色体步移技术（Genome Walking)是一种重要的现 代分子生物学研究技术，可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。 染色体步移技术主要有以下几方面的应用：1.根据基因的已知片段、分子标记 等，获取完整的基因序列，研究其表达调控。如分尚克隆启动子和基因结构并对其进行功能 研究；2.鉴定T-DNA、转座子及外源基因在基因组中的插入位点；3.用于染色体测序工作中 的空隙填补，获得完整的基因组序列。 目前，众多基于PCR技术的染色体步移方法，包括反向PCR法，随机PCR法和接头 连接法等，都有操作复杂、非特异性扩增、连接效率低等弊端。 迄今为止，利用随机引物最成功的是热不对称交错（thermalasymmetric interlacedPCR)TAIL-PCR。这种方法成本相对较低，可直接用PCR进行克隆，不需要DNA 限制性内切酶消化或接头连接反应。随后，TAIL-PCR被广泛应用，尤其是T-DNA插入位点侧 翼序列的克隆，启动子序列的快速分离和全长功能基因的克隆。然而，TAIL-PCR是一个十 分耗时的程序，通常要经过三轮PCR扩增。由于较短的随机兼并引物和低的退火温度，往往 会出现非特异性扩增，也可能会出现目的序列的无效扩增。另外，传统的TAIL-PCR往往会 产生小片段扩增。随后，TAIL-PCR经改进为（hi)TAIL-PCR和FPNI-PCR。但改进的高效率 TAIL-PCR仍然费时费力，并且引物设计与合成的费用昂贵。同时hiTAIL-PCR和FPNI-PCR 技术也遇到了巨大的挑战，如：DNA聚合酶的活性问题和非特异性扩增等，所以往往伴随着 低效率的扩增结果。综上所述，这些改进的方法仍然费时费力，不能发挥传统TAIL-PCR广 泛的应用潜力。因此，进一步开发快速、高效的染色体步移或侧翼序列的克隆的新方法是非 常必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法。 本专利技术所提供的从基因组DNA中获得侧翼序列的方法，命名为Suppression and nested mediated PCR (SNM-PCR)，具体可包括如下步骤： (1)选择基因组DNA上位于待扩增的侧翼序列旁侧的一个已知序列区，根据所述 已知序列区的核苷酸序列设计三条方向一致用于扩增所述侧翼序列的特异性引物，将三条 所述特异性引物按照距离所述侧翼序列由远及近的顺序，依次记为GSPUGSP2和GSP3 ; (2)以所述基因组DNA为模板，以随机兼并引物SAP和所述GSP1进行第一轮PCR 扩增，得到PCR产物1 ; 所述随机兼并引物SAP为如下15种引物中的任一种：核苷酸序列如序列表中序列 1所示的引物SAP 1、核苷酸序列如序列表中序列2所示的引物SAP2、核苷酸序列如序列表中 序列3所示的引物SAP3、核苷酸序列如序列表中序列4所示的引物SAP4、核苷酸序列如序 列表中序列5所示的引物SAP5、核苷酸序列如序列表中序列6所示的引物SAP6、核苷酸序 列如序列表中序列7所示的引物SAP7、核苷酸序列如序列表中序列8所示的引物SAP8、核 苷酸序列如序列表中序列9所示的引物SAP9、核苷酸序列如序列表中序列10所示的引物 SAP 10、核苷酸序列如序列表中序列11所示的引物SAP 11、核苷酸序列如序列表中序列12所 示的引物SAP12、核苷酸序列如序列表中序列13所示的引物SAP13、核苷酸序列如序列表中 序列14所示的引物SAP14、核苷酸序列如序列表中序列15所示的引物SAP15 ; (3)以所述PCR产物1为模板，以叠套引物SEP和所述GSP2进行第二轮PCR扩增， 得到PCR产物2 ; 所述叠套引物SEP由引物A和引物B组成，所述引物A的核苷酸序列为序列表中 序列16,所述引物B的核苷酸序列为序列表中序列17 ; (4)以所述PCR产物2为模板，以引物SNP和所述GSP3进行第三轮PCR扩增，得到 PCR产物3 ;从所述PCR产物3中获得所述侧翼序列； 所述引物SNP的核苷酸序列为序列表中序列18。 在上述方法中，所述叠套引物SEP中，所述引物A和所述引物B的摩尔比可为 (1-2. 5) :10。 在上述方法中，进行三轮PCR扩增时各引物配比如下： (al)进行所述第一轮PCR扩增时，所述随机兼并引物SAP和所述GSP1的摩尔比为 (5 ?10) :1，如 5 :1 ; (a2)进行所述第二轮PCR扩增时，所述叠套引物SEP中的所述引物A、所述引物B， 以及所述GSP2三者的摩尔比为（1-2. 5) :10 :10 ; (a3)进行所述第三轮PCR扩增时，所述引物SNP和所述GSP3的摩尔比为1 :1。 在上述方法中，进行三轮PCR扩增的反应条件如下： (bl)进行所述第一轮PCR扩增的反应条件为：94°C 120s，l个循环；98°C 10s， 60°C 30s，68°C 2min，2 个循环；98°C 10s，25°C 2min，0. 2°C /s(在 25°C -68°C升温过程中，控 制每秒上升〇? 2°C)，68°C 2min，1 个循环；98°C 10s，60°C 30s，68°C 2min，98°C 10s，60°C 30s， 68°C 2min，98°C 10s，44°C 30s，68°C 2min，3-5 个循环；68°C 5min，1 个循环；或 / 和 (b2)进行所述第二轮PCR扩增的反应条件为：94°C 120s ;98°C 10s，60°C 30s， 68°C 2min，30 个循环；68°C 5min ;或 / 和 (b3)进行所述第三轮PCR扩增的反应条件为：94°C 120s ;94°C 10s，60°本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法，包括如下步骤：（1）选择基因组DNA上位于待扩增的侧翼序列旁侧的一个已知序列区，根据所述已知序列区的核苷酸序列设计三条方向一致用于扩增所述侧翼序列的特异性引物，将三条所述特异性引物按照距离所述侧翼序列由远及近的顺序，依次记为GSP1、GSP2和GSP3；（2）以所述基因组DNA为模板，以随机兼并引物SAP和所述GSP1进行第一轮PCR扩增，得到PCR产物1；所述随机兼并引物SAP为如下15种引物中的任一种：核苷酸序列如序列表中序列1所示的引物SAP1、核苷酸序列如序列表中序列2所示的引物SAP2、核苷酸序列如序列表中序列3所示的引物SAP3、核苷酸序列如序列表中序列4所示的引物SAP4、核苷酸序列如序列表中序列5所示的引物SAP5、核苷酸序列如序列表中序列6所示的引物SAP6、核苷酸序列如序列表中序列7所示的引物SAP7、核苷酸序列如序列表中序列8所示的引物SAP8、核苷酸序列如序列表中序列9所示的引物SAP9、核苷酸序列如序列表中序列10所示的引物SAP10、核苷酸序列如序列表中序列11所示的引物SAP11、核苷酸序列如序列表中序列12所示的引物SAP12、核苷酸序列如序列表中序列13所示的引物SAP13、核苷酸序列如序列表中序列14所示的引物SAP14、核苷酸序列如序列表中序列15所示的引物SAP15；（3）以所述PCR产物1为模板，以叠套引物SEP和所述GSP2进行第二轮PCR扩增，得到PCR产物2；所述叠套引物SEP由引物A和引物B组成，所述引物A的核苷酸序列为序列表中序列16，所述引物B的核苷酸序列为序列表中序列17；（4）以所述PCR产物2为模板，以引物SNP和所述GSP3进行第三轮PCR扩增，得到PCR产物3；从所述PCR产物3中获得所述侧翼序列；所述引物SNP的核苷酸序列为序列表中序列18。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张立峰，韩素英，齐力旺，李水根，张俊红，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林业研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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