一种血清miRNA生物标志物组合物与应用制造技术

一种血清miRNA生物标志物组合物与应用，涉及生物标志物。所述血清miRNA生物标志物组合物包括miRNA中的至少一种以及各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列。所述血清miRNA生物标志物组合物可在制备少精症和无精症检测试剂中应用。所述用于少精症和无精症检测的试剂盒包括所述血清miRNA生物标志物组合物以及Taq酶、dNTP、MgCl2和PCR缓冲液。具有灵敏度高、样品消耗量少、检测范围广、定量线性范围宽等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物标志物，尤其是涉及一种血清miRNA生物标志物组合物与应用。
技术介绍
miRNA又称microRNA，是一类由大约22个核苷酸组成的单链非编码RNA，主要利用信使RNA的直接剪切或间接抑制翻译在转录后水平调控靶基因的表达。miRNA在个体发育的不同时期如细胞分化、增殖、凋亡等及不同组织中有不同的表达模式，表明其在发育和分化中起着重要的调控作用。通过对组织miRNA表达谱的研究已经发现，miRNA具有很强的细胞、组织或疾病特异性，这些特异表达的miNRA既是其功能研究的基础，又是很好的疾病标记物。近年的研究显示，miRNA不但与疾病的发生和发展有关，还能够游离于细胞之外，稳定存在于血浆或血清中，具备疾病分子生物标记物的某些特点，目前已经在多种肿瘤和非肿瘤疾病的诊断和预后中显示了独特的价值(Chen X,Ba Y,Ma L,et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell research,2008,18(10):997-1006.)。传统的miRNA检测技术如northern杂交，microarray杂交，对低丰度的miRNA的扩增敏感性差。荧光定量PCR(qRT-PCR)是检测基因表达量最灵敏、可靠的方法，但常规的qRT-PCR<br>技术难以检测约22bp的miRNAs，为克服这个问题，Life Sciences公司等开发了Taqman检测法，但是该方法成本较高，也无法通过溶剂曲线分析PCR发应的特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种血清miRNA生物标志物组合物。本专利技术的第二目的是提供血清miRNA生物标志物组合物在制备少精症和无精症检测试剂中应用。本专利技术的第三目的是提供一种用于少精症和无精症检测的试剂盒。所述血清miRNA生物标志物组合物包括miRNA中的至少一种以及各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列；所述miRNA包括：miR-34c：aggcaguguaguuagcugauugc；miR-1275：gugggggagaggcuguc；miR-375：uuuguucguucggcucgcguga；miR-410：agguugucugugaugaguucg；miR-758：gaugguugaccagagagcacac；各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列如下表所示：所述血清miRNA生物标志物组合物可在制备少精症和无精症检测试剂中应用。所述用于少精症和无精症检测的试剂盒包括所述血清miRNA生物标志物组合物以及Taq酶、dNTP、MgCl2和PCR缓冲液。所述少精症和无精症检测试剂的使用方法如下：1)建立统一标准的标本库和数据库：从医院采集血样样本，同时系统收集患者的病理学资料和临床资料；2)血清miRNA差异表达谱分析：选择健康个体和少精症、无精症患者的血清，提取总RNA，并采用Agilient miRNA芯片筛选技术，对样本的总RNA特异的检测Sanger microRNA数据库(miRBase，19.0版本)的1888个人类相关miRNA，并且能特异性地检测出成熟的miRNA并能很好地区分高度同源的miRNA分子；3)用实时荧光定量PCR方法(茎环法)筛选出可用作检测分子标志物的血清miRNA：对已筛选的血清差异表达的miRNAs在大样本人群中进行定量分析验证，确定能够用于区分正常人和少精症或无精症的miRNA：miR-34c(SEQ ID NO.1)，miR-1275(SEQ ID NO.2)，miR-375(SEQ ID NO.3)，miR-410(SEQ ID NO.4)和miR-758(SEQ ID NO.5)。本专利技术使用的检测方法可以选自：RT-PCR方法、芯片技术、测序技术、荧光定量PCR方法等中的至少一种。本专利技术所述血清miRNA生物标志物组合物、检测方法为少精症和无精症的病理研究提供数据支持，具有以下有益效果：首先，血清相对其它组织较易获得，与睾丸活检或者睾丸穿刺相比，属于无创性检查，极大地方便了医疗人员的使用，减轻了患者的痛苦。其次，miRNAs是一种理想的生物标志物，例如通过无创手段易于获得、高度的敏感性和特异性、具有检测到疾病早期阶段的能力、样本中较长的半衰期以及快速准确的检测能力。最后，用延伸茎环引物的方法，进一步增加了RNA-DNA链互补配对的碱基，提高了其热稳定性，更有利于提高逆转录效率；同时使用SYBR Green荧光染料检测，降低了试验成本。本专利技术首次发现血清中的miRNA可成为无创性诊断少精症和无精症表观遗传病因和机制的新分子标志物。血清中miRNAs非常稳定，对疾病的诊断具有较好的敏感性及特异性，加上取材的相对无创性，显示出了其作为生物标志物的优势，并可带来未来临床医学上的变革。本专利技术基于茎环引物逆转录和SYBR Green qPCR检测法，建立的茎环引物qRT-PCR实时定量检测方法，可以直接通过融解曲线判断PCR反应的特异性。茎环法通过人为地延长miRNA的长度以利于片段的扩增，特异性反转录引物由一段较长的共有序列和一段与miRNA成熟序列特异性互补的序列构成，经过退火反转录后，miRNA被人为延长反转录为较长的cDNA。设计的qPCR扩增正向引物3'端与miRNA反向互补，下游引物与反转录引物共有序列中通用引物的结合位点反向互补。该方法具有灵敏度高、样品消耗量少、检测范围广、定量线性范围宽等优点。附图说明图1为本专利技术miRNA筛选及检测试剂和制备的主要流程。图2为显示以miR-34c，miR-1275，miR-375，miR-410和miR-758作为分子标志物对健康对照组和少精症患者组进行聚类分析结果。图3为显示以miR-34c，miR-1275，miR-375，miR-410和miR-758作为分子标志物对健康对照组和无精症患者组进行聚类分析结果。图4为显示以miR-34c，miR-1275，miR-375，miR-410和miR-758作为分子标志物对健康对照组、少精症患者组和无精症患者组进行聚类分析结果。图5为显示健康对照组和少精症患者组之间的ROC曲线。图6为显示健康对照组和无精症患者组之间的ROC曲线。图7为显示少精症患者组和无精症患者组之间的ROC曲线。具体实施方式以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血清miRNA生物标志物组合物，其特征在于其包括miRNA中的至少一种以及各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列；所述miRNA包括：miR‑34c：aggcaguguaguuagcugauugc；miR‑1275：gugggggagaggcuguc；miR‑375：uuuguucguucggcucgcguga；miR‑410：agguugucugugaugaguucg；miR‑758：gaugguugaccagagagcacac；各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列如下表所示：

【技术特征摘要】
1.一种血清miRNA生物标志物组合物，其特征在于其包括miRNA中的至少一种以及各
miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列；
所述miRNA包括：
miR-34c：aggcaguguaguuagcugauugc；
miR-1275：gugggggagaggcuguc；
miR-375：uuuguucguucggcucgcguga；
miR-410：agguugucugugaugaguucg；
miR-758：gaugguugaccagagagcacac；
各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列如下表所示：
2.如权利要求1所述血清miRNA生物标志物组合物在制备少精症和无精症检测试剂中应
用。
3.用于少精症和无精症检测的试剂盒，其特征在于包括如权利要求1所述血清miRNA生
物标志物组合物，以及Taq酶、dNTP、MgCl2和PCR缓冲液。
4.如权利要求2所述应用，其特征在于所述少精症和无精症检测试剂的使用方法如下：...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾骥孟，李志明，顾龙，庄炫，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35