本发明专利技术涉及一种肿瘤标志物的检测方法，是基于SERS(表面增强拉曼散射)技术的免疫检测，首先在基底上固定抗体；然后加入抗原和偶联有抗体的拉曼探针，这样就在基底上形成了“固相抗体-待测抗原-标记抗体”三明治结构的免疫复合体；最后，对该免疫复合体进行SERS检测，即可高特异性的识别待测物的SERS信号。本发明专利技术被认为是一种具有良好发展前景的检测方法，该方法运用偶联有抗体的金属纳米粒作为SERS基底，可以实现高速、高敏感的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
免疫检测是一种成熟的检测方法，可以应用于生化研究、临床诊断、食品安全和环境检测等领域。ELISA作为一种有效的筛查工具已经广泛应用于患者体内多种蛋白标记物的证实，这一技术允许对小体积样品中的多种标记物进行同时检测。和传统的检测方法相t匕，该技术具有高效、低成本和易于临床应用等显著地优点。但是该技术也有许多技术局限，比如在免疫测定中，为了鉴别一组特定的抗原-抗体，通常会用到分子标签的荧光检测方法，而该技术具有检测限高、光致褪色和不能重复检测等缺点。 本专利技术被认为是一种具有良好发展前景的检测方法，该方法运用偶联有抗体的金属纳米粒作为SERS基底，可以实现高速、高敏感的检测。本专利技术是基于SERS(表面增强拉曼散射)技术的免疫检测，首先在基底上固定抗体；然后加入抗原和偶联有抗体的拉曼探针，这样就在基底上形成了“固相抗体-待测抗原-标记抗体”三明治结构的免疫复合体；最后，对该免疫复合体进行SERS检测，即可高特异性的识别待测物的SERS信号。
技术实现思路
本专利技术的检测是在位于微流控芯片的微通道内的一个典型的三明治免疫复合结构上进行的。首先，用微量注射泵分别把通道内注射充满PBS (磷酸盐缓冲液)缓冲液。使用THF溶液(羧酸)对金表面进行了修饰，为了在该表面上固定抗体还需对其进行活化，即对其上的羧基进行活化。活化的实现，是将0.008mol/L的EDC (1-乙基_3_ (3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐)和0.012mol/L的NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)混合溶液(V:V = 1:1)从进液口以3.lmL/min的流速经30min注射进入微通道进行的。活化完成后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除残余的EDC/NHS溶液。 然后，将10 μ g/mL的anti_XX抗体从进液口经15min注射入微通道，以使它们固定在微通道中经EDC/NHS溶液活化的金基底上。等ant1-XX抗体在金基底上固定好之后，经进液口向微通道注入1%的BSA(牛血清白蛋白)溶液，以封闭微通道中未被特异性结合的羧基。封闭完成后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除残余的BSA溶液。 第三步，将50 μ g/mL的anti_XX抗原经进液口以1.0mL/min的速度注射入微通道，随后将整个芯片培养30min。之后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除没有进行特异性结合的ant1-XX抗原。 最后，将0.008 μ mol/L 的 ant1-XX PcAb-4-MBA-HGNs 经进液口以 3.lmL/min 的流速用15min注射进入微通道，以形成三明治结构的免疫复合物。这一步操作完成以后即可选取SERS微流控芯片的微通道的任意位置进行SERS检测，而后借助软件或人工对所得SERS信号光谱进行分析以实现对待测物的定性、定量分析。 【附图说明】 图1是SERS微流控芯片示意图 图2是8条微通道的SERS信号图 【具体实施方式】 1、检测方法和步骤 首先需要制备具有ant1-XX PcAb_4_MBA (4_巯基苯甲酸)-HGNs (中空金纳米球)结构的SERS探针。在加入多克隆抗体ant1-XX这一步，分别加入CA153和CA125抗体制成ant1-CA153PcAb-4-MBA-HGNs 和 ant1-CA125PcAb-4-MBA_HGNs 两种 SERS 探针。 实验开始之前，需事先准备若干SERS微流控芯片，其中F、G、H三条微通道底面上溅射有金纳米颗粒，其结构示意图如图1所示。 对照品的准备。首先，关闭除A阀门以外的所有阀门，用微量注射泵将A通道注满双蒸水后关闭A阀门。然后，打开B阀门，用微量注射泵将B通道注满I %的BSA溶液后关闭B阀门。打开C阀门，用微量注射泵将C通道注满PBS溶液后关闭C阀门。最后，依次打开D、E两个阀门，用微量注射泵将与它们对应的通道依次注满ant1-CA153PcAb-4-MBA-HGNs和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs探针溶液后依次关闭D、E两个阀门。 待测样品的准备。对上述几种待测样品，严格按照上述步骤进行实验操作。首先，开启微流控芯片上的F、G、H三个阀门，用微量注射泵从进液口向对应的3条通道内注射PBS缓冲液至充满，而后将0.008mol/L的EDC和0.012mol/L的NHS混合溶液(V:V = I:1)从进液口以3.lmL/min的流速注射进入微通道对金基底活化30min。活化完成后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除残余的EDC/NHS溶液。 然后，依次打开F、G、H三个阀门，分别将10μ g/mL的anti_CA153、anti_CA125和ant1-Ab抗体从进液口经15min分别注射入微通道，以使它们固定在微通道中经EDC/NHS溶液活化的金基底上。等ant1-XX McAbs抗体在金基底上固定好之后，经进液口向微通道注入1%的BSA溶液，以封闭F、G、H三个通道中未被特异性结合的羧基。封闭完成后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对F、G、H三个微通道进行清洗，以清除残余的EDC/NHS溶液。 第三步，依次打开F、G、H三个阀门，分别将50 μ g/mL的anti_CA153、anti_CA125和ant1-Ab抗原经进液口以1.0mL/min的速度分别注射入对应的微通道，随后将整个芯片培养30min。之后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除没有进行特异性结合的ant1-XX抗原。 最后，打开F、G、H 三个阀门，将 0.008 μ mol/L 的 ant1-CA153PcAb-4-MBA_HGNs 和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs的混合液经进液口以3.lmL/min的流速注射进入微通道，以形成三明治结构的免疫复合物。这一步操作完成以后即可选取SERS微流控芯片微通道上的任意位置进行SERS检测，而后借助软件或人工对所得SERS信号光谱进行分析以实现对待测物质的定性、定量分析。 2、实验结果及分析 通过移动激光光斑到每一微通道上，在静态条件下检测SERS信号。每条通道上检测点应选取在离进液口或出液口相同距离的位置处。在试验中，使用了一个具有两个狭缝的光学结构来减弱未聚焦激光束的背景拉曼散射。在拉曼系统中，用入射狭缝和CCD(电荷耦合探测器)检测器上的像素配合从而取代了小孔的功能。设置第一聚焦狭缝的宽度为15mm。微通道中的三明治结构的免疫复合物的拉曼光谱用50倍物镜在共聚焦模式下检测。积分时间5000ms。 实验中分别设定SERS探针在微通道内的停留时间为2min、5min、lOmin、15min、20min,对选定点进行SERS检测，发现在2min时基本检测不到SERS信号，时间为5min及更长时可以检测SERS信号，且随着时间的延长SERS信号呈逐步增加趋势。这一结果说明，SERS强度受SERS探针的停留时间影响较为明显，即提供足够的接触时间以增加免疫复合体的装载本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肿瘤标记物的检测方法，其特征是，包括以下步骤：(1)首先需要制备具有anti‑XX PcAb‑4‑MBA‑HGNs结构的SERS探针。在加入多克隆抗体anti‑XX这一步，分别加入CA153和CA125抗体制成anti‑CA153PcAb‑4‑MBA‑HGNs和anti‑CA125PcAb‑4‑MBA‑HGNs两种SERS探针。实验开始之前，需事先准备若干SERS微流控芯片，其中F、G、H三条微通道底面上溅射有金纳米颗粒。对照品的准备。首先，关闭除A阀门以外的所有阀门，用微量注射泵将A通道注满双蒸水后关闭A阀门。然后，打开B阀门，用微量注射泵将B通道注满1％的BSA溶液后关闭B阀门。打开C阀门，用微量注射泵将C通道注满PBS溶液后关闭C阀门。最后，依次打开D、E两个阀门，用微量注射泵将与它们对应的通道依次注满anti‑CA153PcAb‑4‑MBA‑HGNs和anti‑CA125PcAb‑4‑MBA‑HGNs探针溶液后依次关闭D、E两个阀门。待测样品的准备。对上述几种待测样品，严格按照上述步骤进行实验操作。首先，开启微流控芯片上的F、G、H三个阀门，用微量注射泵从进液口向对应的3条通道内注射PBS缓冲液至充满，而后将0.008mol/L的EDC和0.012mol/L的NHS混合溶液(V：V＝1：1)从进液口以3.1mL/min的流速注射进入微通道对金基底活化30min。活化完成后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除残余的EDC/NHS溶液。(2)然后，依次打开F、G、H三个阀门，分别将10μg/mL的anti‑CA153、anti‑CA125和anti‑Ab抗体从进液口经15min分别注射入微通道，以使它们固定在微通道中经EDC/NHS溶液活化的金基底上。等anti‑XX McAbs抗体在金基底上固定好之后，经进液口向微通道注入1％的BSA溶液，以封闭F、G、H三个通道中未被特异性结合的羧基。封闭完成后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对F、G、H三个微通道进行清洗，以清除残余的EDC/NHS溶液。(3)第三步，依次打开F、G、H三个阀门，分别将50μg/mL的anti‑CA153、anti‑CA125和anti‑Ab抗原经进液口以1.0mL/min的速度分别注射入对应的微通道，随后将整个芯片培养30min。之后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微通道进行清洗，以清除没有进行特异性结合的anti‑XX抗原。(4)最后，打开F、G、H三个阀门，将0.008μmol/L的anti‑CA153PcAb‑4‑MBA‑HGNs和anti‑CA125PcAb‑4‑MBA‑HGNs的混合液经进液口以3.1mL/min的流速注射进入微通道，以形成三明治结构的免疫复合物。这一步操作完成以后即可选取SERS微流控芯片微通道上的任意位置进行SERS检测，而后借助软件或人工对所得SERS信号光谱进行分析以实现对待测物质的定性、定量分析。...
【技术特征摘要】
1.一种肿瘤标记物的检测方法，其特征是，包括以下步骤: (1)首先需要制备具有ant1-xxPcAb-4-MBA-HGNs结构的SERS探针。在加入多克隆抗体 ant1-XX 这一步，分别加入 CA153 和 CA125 抗体制成 ant1-CA153PcAb-4-MBA_HGNs 和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs 两种 SERS 探针。 实验开始之前，需事先准备若干SERS微流控芯片，其中F、G、H三条微通道底面上溅射有金纳米颗粒。 对照品的准备。首先，关闭除A阀门以外的所有阀门，用微量注射泵将A通道注满双蒸水后关闭A阀门。然后，打开B阀门，用微量注射泵将B通道注满I %的BSA溶液后关闭B阀门。打开C阀门，用微量注射泵将C通道注满PBS溶液后关闭C阀门。最后，依次打开D、E两个阀门，用微量注射泵将与它们对应的通道依次注满ant1-CA153PcAb-4-MBA-HGNs和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs探针溶液后依次关闭D、E两个阀门。 待测样品的准备。对上述几种待测样品，严格按照上述步骤进行实验操作。首先，开启微流控芯片上的F、G、H三个阀门，用微量注射泵从进液口向对应的3条通道内注射PBS缓冲液至充满，而后将0.008mol/L的EDC和0.012mol/L的NHS混合溶液(V:V = I:1)从进液口以3.lmL/min的流速注射进入微通道对金基底活化30min。活化完成后再从进液口向通道中持续注入PBS溶液5min对微...
【专利技术属性】
技术研发人员：王倩，鲍军波，姚波，刘佩莉，
申请(专利权)人：天津市医药科学研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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