本发明专利技术提供了成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂如试剂盒、细胞芯片中的应用。证实了RA患者血清中存在能与成纤维样滑膜细胞结合的特异性抗体。建立了以成纤维样滑膜细胞为底物抗原的间接免疫荧光方法和细胞芯片检测方法，对RA的诊断具有较高的敏感性和特异性，为RA的诊断提供了新的诊断试剂和方法。
【技术实现步骤摘要】
成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用
本专利技术涉及类风湿关节炎诊断试剂技术，具体地说，是成纤维样滑膜细胞在制备 类风湿关节炎诊断试剂中的应用，属于医学领域。
技术介绍
类风湿关节炎（rheumatoid art虹itis，RA)是一种系统性自身免疫性疾病，主要 累及周围关节，表现为慢性、对称性、进行性关节炎。RA的病理改变最初表现为关节滑膜增 生，并逐渐向软骨、骨及周围肌膊侵犯，最终导致关节破坏、关节崎形及功能丧失。RA多发 于中年女性，患病率在我国为0. 32%?0. 36%，在欧美国家则高达1%。RA的病因目前尚不 清楚，主要与感染因素、遗传因素及激素水平改变有关，其临床表现主要W关节症状为主， 表现为晨僵、关节痛、关节肿胀及关节崎形。关节外表现主要包括类风湿结节、类风湿血管 炎及肺损坏、肾脏损坏和也脏损坏。RA的诊断主要依据美国风湿病学会1987年RA分类标 准；（1)晨僵持续1小时，病程至少6周；（2)有3个或3个W上的关节肿，至少6周；（3) 腕、掌指、近端关节肿，至少6周；（4)对称性关节肿，至少6周；（5)有皮下结节；（6)手X 线改变；（7)血清类风湿因子（RF)升高；满足4条或4条W上并排除其他关节炎即可诊断 为RA。2012年最新的美国风湿病学会RA分类标准中添加了抗环瓜氨酸肤抗体(抗CCP抗 体）作为RA诊断的检测指标。从上述RA诊断标准看，该疾病的诊断主要依靠临床表现结 合放射性检查及实验室检测指标。在已知的RA相关的自身抗体当中，类风湿因子敏感性为 60%?70%，特异性为86% ;抗角蛋白抗体（AKA)敏感性为44%?73%，特异性为90% ;抗核周 因子抗体（APF)敏感性为48%?66%，特异性为92% ;抗聚角蛋白微丝蛋白抗体（AFA)敏感 性为47%?69%，特异性为93% ;抗CCP抗体敏感性为47%?82%，特异性为96%。虽然该些 RA实验室检测指标已经达到相当高的敏感性和特异性，但据统计，在RA当中仍有20%左右 患者呈RF和CCP双阴性，所W，寻求敏感性和特异性更高的RA检测指标及方法，仍是该疾 病临床研究的重点课题。 上述的自身抗体检测都是W特定蛋白或多肤为抗原底物，通过抗原抗体反应的原 理设计检测血清中针对该蛋白或多肤的抗体。该些抗原底物的来源主要通过分离提纯、重 组表达或体外化学合成（多肤）获得，通过上述方法获得的抗原底物与体内天然存在的抗原 在理化性质、生物活性或空间构象上存在一定差异，应用该样得到的抗原底物对其血清抗 体进行检测会不可避免的造成误差。为避免上述问题，研究者采用间接免疫英光的方法对 疾病进行定性诊断。该方法是将某种特定细胞为底物抗原固定在固相载体上，如载玻片，将 待测血清与其反应，再通过带英光的抗人IgG二抗与血清中能和细胞反应的抗体结合，从 而在英光显微镜下观察英光强度来判断血清中含抗该细胞抗体多少，与标准阳性血清或阴 性血清比较，从而判断待测血清的阴阳性。因为该方法操作简便，判断直观，在临床上得到 广泛应用。 抗细胞抗体在临床上应用较多的有如下检测；（1)抗内皮细胞抗体检测是W人厮 静脉内皮细胞为底物抗原，用于白色病（BD)的辅助诊断；其在BD中的敏感性为54. 8%，特异 性为87. 2% ;而在系统性红斑狼疮（SLE)、系统性硬化症（SSc)及RA中阳性率分别为8%、9% 及10% ; (2)抗巨核细胞抗体检测是W人巨核细胞为底物抗原，主要用于SLE的辅助诊断； (3)抗人肾脏集合管细胞抗体检测主要用于肾脏疾病的辅助诊断；（4)抗壁细胞抗体检测 主要用于恶性贫血的辅助诊断。 蛋白芯片具有高通量、平行检测、自动化等优点，为简便、快速、同时检测多种自身 抗体问题的解决带来了希望，在临床疾病诊断等领域中发挥了重要的作用。既往的蛋白芯 片在制备过程中所点的样都是特定的抗原(用其来检测特异性抗体)，其来源大多数为通过 基因工程方法重组表达而成。重组表达的蛋白抗原，无论是原核或真核表达，其蛋白产物在 理化性质、生物学活性或免疫学性质上与天然存在的蛋白之间多少存在差异，该样会导致 用该蛋白检测人体特异性抗体的时候产生误差。直接用原代培养的细胞作为底物，由于细 胞中表达的蛋白与体内细胞比较相差最小，在针对检测该细胞蛋白抗体时比重组表达的蛋 白更具优势。现有技术中尚无采用一定数量的成纤维样滑膜细胞点样来检测血清中相应抗 体含量从而对RA进行实验室诊断的报道。 RA发病机制至今尚不明确，据研究报道可能参与RA疾病发生的细胞多达十余种。 其中，目前得到公认的是CD4+T细胞，尤其是化17细胞被认为在RA发病中起主要作用。而 其他效应细胞，如成纤维样滑膜细胞、软骨细胞、服大细胞、巨瞻细胞等在RA发病机制中也 扮演不同角色。然而就RA而言，现有技术中未公开哪种细胞蛋白能作为抗原底物通过检测 患者血清中抗体达到辅助诊断的目的，且很多细胞参与RA疾病发生并非通过抗体发挥作 用。已知的人体内细胞的种类不计其数，在RA中如何寻找一种细胞，针对其蛋白底物进行 自身抗体检测W建立具有高度敏感性和特异性的辅助诊断方法仍是本领域的难点。 正常滑膜衬里层细胞包括巨瞻细胞样滑膜细胞、成纤维样滑膜细胞 (fibroblast-1化e synovial cells,简称化S)和树突状滑膜细胞。在RA发病机制中，一 致认为成纤维样滑膜细胞的过度增生和对软骨的破坏是造成关节病理改变的根本原因，它 是参与RA滑膜炎症反应的效应细胞，但就成纤维样滑膜细胞在制备RA诊断试剂中的应用 却未见报道，对于本领域技术人员来说，成纤维样滑膜细胞能用于诊断RA也是非显而易见 的。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关 节炎诊断试剂中的应用。 本专利技术的再一的目的是，提供一种成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试 剂盒中的应用。 本专利技术的另一的目的是，提供一种成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断细 胞芯片中的应用。 为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是： 成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用。 所述的成纤维样滑膜细胞是体外培养的人成纤维样滑膜细胞。 为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是： 成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂盒中的应用。 所述的诊断试剂盒中包括体外培养的人成纤维样滑膜细胞及间接免疫英光检测 法所用的其他试剂。 所述的间接免疫英光检测法的步骤为： (1) 将体外培养的人成纤维样滑膜细胞固定； (2) 用含BSA的PBS封闭液封闭； (3) 取待测血清赔育固定的成纤维样滑膜细胞； (4) 切3标记的羊抗人IgG二抗赔育； (5) DAPI溶液染核； (6) 英光显微镜观察，类风湿关节炎患者血清赔育的成纤维样滑膜细胞胞浆均匀着色， 其他患者及正常人血清赔育的成纤维样滑膜细胞胞浆均不着色。 所述的英光显微镜观察条件为；使用铅滤光片，激发波长554nm，发射波长570nm。 为实现上述第H个目的，本专利技术采取的技术方案是： 成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断细胞芯片中的应用。 所述的细胞芯本文档来自技高网...
【技术保护点】
成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用。
【技术特征摘要】
1. 成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的成纤维样滑膜细胞是体外培养的 人成纤维样滑膜细胞。3. 成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂盒中的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的诊断试剂盒中包括体外培养的人 成纤维样滑膜细胞及间接免疫荧光检测法所用的其他试剂。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的间接免疫荧光检测法的步骤为： (1) 将体外培养的人成纤维样滑膜细胞固定； (2) 用含BSA的PBS封闭液封闭； (3) 取待测血清孵育固定的成纤维样滑膜细胞； (4) Cy3标记的羊抗人IgG二抗孵育； (5) DAPI溶液染核； (6) 荧光显微镜观察，类风湿关节炎患者血清孵育的成纤维样滑膜细胞胞浆均匀着色， 其他患者及正常人血清孵育的成纤维样滑膜细胞胞浆均不着色。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的荧光显微镜观察条件为：使用铬滤 光片，激发波长554nm，发射波长570nm...
【专利技术属性】
技术研发人员：李立，
申请(专利权)人：李立，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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