SV40LT基因诱导构建T淋巴细胞模型及其细胞库制造技术

本发明专利技术涉及用于医学研究领域的SV40LT基因诱导T淋巴细胞模型及其细胞库的构建，其主要特征是按常规以T4DNA连接酶、BamHI、pcDNA3.1(-)DNA及SV40LTag DNA构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子、以感受态大肠杆菌纯化重组子、以脂质体转染法将其导入体外培养的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞，作传代、扩大培养，筛选细胞形态、细胞生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞生物特性者作为T淋巴细胞模型冻存于液氮中，以此构建SV40LT基因诱导T淋巴细胞模型及其细胞库，以建立在体外长期传代培养T淋巴细胞的方法并用于体外研究T淋巴细胞免疫机制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及SV40LT基因(猴肾病毒40大T抗原基因)诱导(介导)构建T淋巴细胞模型及其细胞库，主要用于医学免疫学研究领域，为开展T淋巴细胞或与T淋巴细胞相关的各种研究提供细胞模型并保存其科研资源。
技术介绍
人类血液中的有形成份分为红细胞、白细胞和血小板。其中的白细胞以中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞为主。淋巴细胞又分为T淋巴细胞(T细胞)和B淋巴细胞(B细胞)等。已知T细胞是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞。按其功能可分为三个亚群：辅助性T细胞、抑制性T细胞和细胞毒性T细胞。T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。T细胞是相当复杂的不均一体、又不断在体内更新、在同一时间可以存在不同发育阶段或功能的亚群。按免疫应答中的功能不同，又可将T细胞分成若干亚群，一致公认的有：辅助性T细胞(Helper T cells，Th)，具有协助体液免疫和细胞免疫的功能；抑制性T细胞(Suppressor T cells，Ts)，具有抑制细胞免疫及体液免疫的功能；效应T细胞(Effector T cells，Te)，具有释放淋巴因子的功能；细胞毒T细胞(cytotoxic T cells，Tc)，具有杀伤靶细胞的功能；迟发性变态反应T细胞(Td)，有参与IV型变态反应的作用；放大T细胞(Ta)，可作用于Th和Ts，有扩大免疫效果的作用；处女或天然T细胞(Virgin or Natural T cells)，他们和抗原接触后分化成效应T细胞和记忆T细胞；记忆T细胞(Tm)，有记忆特异性抗原刺激的作用。其中，Th细胞又被称为CD4+细胞，因为其在表面表达CD4(cluster of differentiation 4)。通过与MHC II(主要组织相容性复合体，major histocompatibility complex)递呈的多肽抗原反应被激活。MHC II在抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)表面表达。一旦激活，可以分泌细胞因子，调节或者协助免疫反应。Tc细胞又名为CD8+细胞，其表面表达CD8.这类细胞可以通过MHCI与抗原直接结合。T淋巴细胞还可进一步分为辅助／诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+)、抑制／细胞毒T淋巴细胞(CD3+CD8+)、CD4+T细胞纯真亚群(CD4+CD45RA+／CD4+CD45RA+62L+)和记忆亚群(CD4+CD45RA-／CD4+CD45RO+)、功能亚群(CD28+)、激活亚群(CD38+、HLA-DR+)、凋亡亚群(CD95+)等。T细胞是淋巴细胞的主要组分，T细胞的正常功能对人类抵御疾病非常重要。T细胞不产生抗体，其免疫应答是细胞免疫，如与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强；辅助或抑制B细胞产生抗体。在抵御疾病感染、肿瘤形成中起重要作用。而B细胞是通过产生抗体起作用。抗体存在于体液里，所以B细胞的免疫作用叫作体液免疫。淋巴细胞的平均寿命一般为7天左右，不能在体外较长时间的传代培养。因为淋巴细胞在体外培养时易于在短时间内死亡，所以难以开展需在体外长期培养的淋巴细胞生物学功能的研究。为了解决这个问题，国内外文献报道用EB病毒转染法使B淋巴细胞永生化，建立B淋巴细胞系(株)，以满足上述科研的需要。建立这种永生B淋巴细胞系的原理基于B淋巴细胞表面有EB病毒的受体。而T淋巴细胞的表面没有EB病毒的受体，所以就无法用该方法来建立永生化T淋巴细胞系。至今未见有关可在体外长期传代培养的T淋巴细胞系的建立方法。国外文献报道，猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的建立，据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制。根据文献报道，Reilly用猿猴病毒(SV40)大T抗原基因转化来建立血管平滑肌细胞株，构建细胞模型以研究肝素对血管平滑肌的抑制作用机制。Su等利用经SV40转化的角化上皮细胞株，构建细胞模型来分析上皮细胞内蛋白质合成的调控作用。Miquel等用SV40转化的角化上皮细胞株，作为细胞模型研究层粘连蛋白5介导的细胞粘附作用。Webber等用经SV40转化的前列腺上皮细胞株作为细胞模型来研究前列腺上皮细胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用经Ad12-SV40转化肾小管上皮细胞模型来研究近曲小管的损伤和疾病。Hougton等用SV40转化建立骨髓基质细胞株作为细胞模型以研究在一定培养条件下，细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞的双向分化的潜能，进一步研究骨质疏松的机制。因研究工作的需要，几乎每种疾病都建立了各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型。等等。
技术实现思路
为了解决目前无法建立可在体外长期传代培养并可用于体外研究T淋巴细胞免疫机制的T淋巴细胞模型的问题，本专利技术人提出了本专利技术。本专利技术的目的是要提供以SV40LT基因诱导永生T淋巴细胞模型及其细胞库的构建方法，另一目的是为在体外研究T淋巴细胞的免疫机制提供SV40LT基因诱导永生T淋巴细胞模型及其细胞库。本专利技术的目的是这样实现的：以T4DNA连接酶连接同时经BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离的SV40LTag DNA，构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组质粒，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞以扩增、纯化并挑取耐氨苄青霉素的菌落抽提质粒，以脂质体转染法导入体外培养的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞，作传代、扩大培养，筛选细胞形态、细胞生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为T淋巴细胞模型冻存于液氮中，以此构建SV40LT基因介导T淋巴细胞模型及其细胞库。本专利技术以PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳提纯的SV40大T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于医学研究领域的SV40LT基因诱导T淋巴细胞模型及其细胞库的构建，其主要特征是按常规以T4DNA连接酶、BamHI、pcDNA3.1(‑)DNA及SV40LTag DNA构建SV40LTag‑pcDNA3.1(‑)重组子、以感受态大肠杆菌纯化重组子、以脂质体转染法将其导入体外培养的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞，作传代、扩大培养，筛选细胞形态、细胞生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞生物特性者作为T淋巴细胞模型冻存于液氮中，以此构建SV40LT基因介导T淋巴细胞模型及其细胞库，以建立在体外长期传代培养T淋巴细胞的方法并用于体外(替代人体或动物直接试验)研究T淋巴细胞免疫机制。

【技术特征摘要】
1.一种用于医学研究领域的SV40LT基因诱导T淋巴细胞模型及其细胞库的构建，其主
要特征是按常规以T4DNA连接酶、BamHI、pcDNA3.1(-)DNA及SV40LTag DNA构建
SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子、以感受态大肠杆菌纯化重组子、以脂质体转染法将其导入体
外培养的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞，
作传代、扩大培养，筛选细胞形态、细胞生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞
DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞生物特性
者作为T淋巴细胞模型冻存于液氮中，以此构建SV40LT基因介导T淋巴细胞模型及其细胞库，
以建立在体外长期传代培养T淋巴细胞的方法并用于体外(替代人体或动物直接试验)研究T
淋巴细胞免疫机制。
2.根据权利要求1所述的SV40LT基因诱导T淋巴细胞模型及其细胞库的构建，其特征
是所指细胞模型为(1)T淋巴细胞转染了SV40LT基因而成为可长期传代培养的永生化T淋巴
细胞模型；(2)T淋巴细胞模型的染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”；(3)细胞的
生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepato ZYME-SFM无血清培养基中呈
“S”特征或“穹隆”形成；(4)细胞不能在软琼脂内生长(形成克隆)；(5)细胞为非恶化细
胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)因细胞的DNA中整合了SV40大T抗原基因，所以表达SV40大T
抗原mRNA产物；(7)体外连续培养6-8周(第55代)仍处于对数生长期；(8)能反复冻存、长
期传代培养；(9)用于研究T淋巴细胞的功能和免疫机制；⑩可再生...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，黄荷凤，徐晨明，鲁林荣，袁武锋，张燕，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江;33