本发明专利技术涉及用于医学研究领域的SV40LT抗原基因转导先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库的构建，其主要特征是按常规以T4DNA连接酶、BamHI、pcDNA3.1(-)DNA及SV40LTag DNA构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子，经感受态大肠杆菌纯化后导入经胶原酶II消化的离体传代、呈对数生长的先天性心脏病室间隔缺损细胞，使重组子与DNA整合，并扩大培养经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞SV40大T基因检测、mRNA产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT转导先天性心脏病室间隔缺损体外研究细胞模型，为在体外从细胞水平长期研究其发病机制奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
转导SV40LT抗原基因构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库
本专利技术涉及转导SV40LT抗原基因(猴肾病毒40大T抗原基因)构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库，主要用于医学心血管病研究领域，为先天性心脏病室间隔缺损的研究提供细胞模型并保存其科研资源。
技术介绍
先天性心脏病室间隔缺损是发病率最高的出生缺陷之一，已成为严重的社会问题。我国每年新发先天性心脏病11.2万-16.0万例，将造成经济损失109亿-156亿；先天性心脏病的治疗费每年高达120亿元，给社会和家庭造成了严重的心理负担和精神痛苦，已严重影响我国的人口质量，已成为社会发展的沉重负担和可持续发展的严重障碍。 先天性心脏病等出生缺陷的研究及干预已成为我国政府行为，党中央《决定》自2006年开始实施“出生缺陷干预工程”；中华人民共和国主席令《1994年10月27日第三十三号》公布我国自1995年6月1日起施行(出生缺陷)产前诊断的有关法规标准；全国人民代表大会相继颁布了《中华人民共和国母婴保健法》、《中华人民共和国母婴保健法实施办法》等一系列法规，促进了出生缺陷产前诊断、干预工作的开展；在《国民经济和社会发展的第十一个五年规划纲要》中强调加大出生缺陷干预力度，改善出生人口素质；在《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》中将出生缺陷的研究列为优先主题。 目前认为先天性心脏病室间隔缺损是遗传和环境因素等复杂关系相互作用的结果，主要包括①.胎儿发育的环境因素:如妊娠前三个月患病毒或细菌感染尤其是风疹病毒，其次是柯萨奇病毒，其出生的婴儿先天性心脏病的发病率较高。其它如羊膜的病变，胎儿受压，妊娠早期先兆流产，母体营养不良、糖尿病、苯酮尿、高血钙，放射线和细胞毒性药物在妊娠早期的应用，母亲年龄过大等均有使胎儿发生先天性心脏病的可能。②遗传因素:多数的先天性心脏病是由多个基因与环境因素相互作用所形成。③其他因素:与地区、性别也有关系。 近年来，对先天性心脏病等出生缺陷的研究主要是针对遗传、生物、物理、化学因素与发病(率)的关系进行流行病学方面的调查研究。但是，由于没有可在体外长期培养的、可用于先天性心脏病发病机制研究的永生细胞模型及其细胞库，就难以从细胞水平在体外研究先天性心脏病室间隔缺损细胞受物理、化学、生物、遗传等影响的基因突变、基因表达、功能改变、生理特性、生物传导等机制，从而严重限制了先天性心脏病室间隔缺损出生缺陷的进一步研究。 国外文献报道，猴肾病毒40 (SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的建立，据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制。 根据文献报道，Reilly用猿猴病毒(SV40)大T抗原基因转化来建立血管平滑肌细胞株，构建细胞模型以研究肝素对血管平滑肌的抑制作用机制。Su等利用经SV40转化的角化上皮细胞株，构建细胞模型来分析上皮细胞内蛋白质合成的调控作用。Miquel等用SV40转化的角化上皮细胞株，作为细胞模型研究层粘连蛋白5介导的细胞粘附作用。Webber等用经SV40转化的前列腺上皮细胞株作为细胞模型来研究前列腺上皮细胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用经Adl2_SV40转化肾小管上皮细胞模型来研究近曲小管的损伤和疾病。Hougton等用SV40转化建立骨髓基质细胞株作为细胞模型以研究在一定培养条件下，细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞的双向分化的潜能，进一步研究骨质疏松的机制。 因研究工作的需要，几乎每种疾病都建立了各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型。等等。 但是，至今尚未见有关构建可用于在体外从细胞水平研究先天性心脏病室间隔缺损发病机制的永生细胞模型及其细胞库的文献报道，也无法开展相关的研究项目。为了解决上述问题，本专利技术人提出了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供以SV40LT抗原基因转导(介导)先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库的构建方法，另一目的是为在体外从细胞水平研究先天性心脏病室间隔缺损的发病机制提供SV40LT抗原基因介导先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库。 本专利技术的目的是这样实现的:以T4DNA连接酶连接同时经BamHI酶切的pcDNA3.1 (-)DNA和PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离的SV40LTag DNA,构建SV40LTag-pcDNA3.1 (-)重组质粒，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞以扩增、纯化并挑取耐氨苄青霉素的菌落抽提质粒，以脂质体转染法导入经胶原酶II消化的离体传代先天性心脏病室间隔缺损羊水组织细胞或在含20%胎牛血清、5?lOnmol / L胰岛素的培养液中处于将进入或刚进入对数生长期、梭形细胞占90%以上、汇合率达55%?65%的贴壁生长先天性心脏病室间隔缺损羊水组织细胞，使重组子与细胞的DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞，作传代、扩大培养，筛选细胞形态、细胞生长曲线、染色体核型、软琼脂集落生长试验、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为细胞模型冻存于液氮中，以此构建SV40LT抗原基因介导先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库。 本专利技术以PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳提纯的SV40大T抗原基因经基因载体pcDNA3.1和脂质体转染法导入先天性心脏病室间隔缺损细胞而构建其细胞模型，其组织细胞用0.01%胶原酶II消化而不用常规的胰蛋白酶消化，以仅使引起细胞粘连的胶原被消化或使细胞悬浮，减少了细胞壁的蛋白质被消化而伤及细胞，使细胞培养的成功率由一般的约85%提高到95%以上；选用了含20mL / L胎牛血清、5?lOnmol / L胰岛素的特定培养基，使细胞不会生长过快而影响SV40大T抗原基因的整合，也不会因缺少营养或细胞生长刺激因子而使细胞在未达到要求的汇合率、未进入对数生长期前就过早死亡，或对数生长期缩短；制备的细胞系在_196°C液氮中冻存1个月后复苏培养，均能生长出贴壁细胞；在作细胞系染色体鉴定时，秋水仙素的用量及作用时间是常规的5?10倍，使染色体分裂相增加，足以计数和分析；由此建成的先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库，为从细胞水平在体外研究先天性心脏病室间隔缺损的发病机制奠定基础。 【附图说明】 图1是本专利技术制备的先天性心脏病室间隔缺损细胞模型(贴壁生长)图。 如图1，细胞传代至第70代、培养至第7天时，呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达80%以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢、变疏。 【具体实施方式】 1、SV40大T抗原DNA的提取:①SV40D本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于医学研究领域的转导SV40LT抗原基因构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库，其主要特征是按常规以T4DNA连接酶、BamHI、pcDNA3.1(‑)DNA及SV40LTagDNA构建SV40LTag‑pcDNA3.1(‑)重组子、以感受态大肠杆菌纯化重组子、以脂质体转染法将其导入经胶原酶II消化的离体传代或呈对数生长的先天性心脏病室间隔缺损组织细胞，使重组子与细胞的DNA整合，并扩大培养经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、软琼脂集落生长、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT抗原基因介导先天性心脏病室间隔缺损体外研究细胞模型(替代人体或动物直接试验)冻存于液氮中。
【技术特征摘要】
1.一种用于医学研究领域的转导SV40LT抗原基因构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库，其主要特征是按常规以T4DNA连接酶、BamHI, pcDNA3.1 (-)DNA及SV40LTagDNA构建SV40LTag-pcDNA3.1 (-)重组子、以感受态大肠杆菌纯化重组子、以脂质体转染法将其导入经胶原酶II消化的离体传代或呈对数生长的先天性心脏病室间隔缺损组织细胞，使重组子与细胞的DNA整合，并扩大培养经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、软琼脂集落生长、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT抗原基因介导先天性心脏病室间隔缺损体外研究细胞模型(替代人体或动物直接试验)冻存于液氮中。2.根据权利要求1所述的转导SV40LT抗原基因构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库，其特征是所指细胞模型为(I)细胞在倒置光学显微镜下呈梭形或小园形的上皮细胞样贴壁生长；(2)细胞的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepato ZYME-SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)细胞染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，xY”，或相同于本发明采集的原始细胞；(4)细胞不能在软琼脂内生长(形成克隆)；(5)细胞为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)细胞的DNA中整合了 SV40大T抗原基因，表达SV40大T抗原mRNA产物；(7)细胞传代至第70代、培养至第7天时，呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达80 %以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢；(8)用于在体外从细胞水平研究环境因素致先天性心脏病室间隔缺损的发病机制、研究对环境有害物的耐受性并作为遗传资源贮存。3.根据权利要求1所述的转导SV40LT抗原基因构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库，其特征是取自因其他实验所需而采集的、并在其他实验后多余、废弃的先天性心脏病室间隔缺损患儿羊水脱落细胞构建之。4.根据权利要求1所述的转导SV40LT抗原基因构建先天性心脏病室...
【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，黄荷凤，徐晨明，李晓，杨红卫，陈雁，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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