用RNAi有效防治农业害螨的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及沉默一个能量代谢基因防治叶螨的方法。根据本发明专利技术的方法包括以下步骤：选取叶螨致死基因AK为RNAi靶基因；将其连接至质粒载体L4440中，转化至大肠杆菌HT115，获得具有表达AK基因dsRNA的菌株。本发明专利技术是对以杀虫剂为主的叶螨防治方法的重要补充。本发明专利技术利用RNAi技术干扰叶螨体内的能量代谢相关基因的表达，为防治叶螨提供了技术支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农业生物
；更具体地，本专利技术涉及基于RNAi技术防治农业害螨的靶标基因及其dsRNA，描述了将靶标基因合成为双链RNA制剂并直接应用于农业害螨防治的方法。 技术背景在我国，目前对农业害螨还没有有效防治方法，喷施杀虫剂仍然是主要防治手段。高毒高残留农药的滥施，不仅导致农作物产品质量下降，害螨抗药性的增加，而且已危及人们的生命安全和健康。因此，生产上迫切需要发展安全、有效、新型的策略来控制害螨种群的危害。 RNAi现象自从1991年发现以来迅速发展，研究表明，通过特异基因的RNAi，可以达到定向干涉物种的靶基因，出现某些生理现象，达到研究基因功能的目的，同时，这种现象有着极高的特异性，即同源基因的特定片段对不同物种所发挥的干涉效果并不相同，因此是一种理想的害虫种类特异的防治体系。 迄今为止通过dsRNA诱导的RNAi已被广泛用来研究昆虫基因的功能，但是应用于螨类的研究极少(Khila，2007；Campbell，2010)，这主要是因为螨类个体微小(身体多在1毫米以下)，使用RNAi分子技术操作困难。Khila等(2007)使用dsRNA注射腹部，成功沉默了二班叶螨(Tetranychus urticae)的Distal-less基因，导致叶螨须肢截断畸形和附足融合。将绿色荧光蛋白GFP标记的dsRNA分子注射入雌成螨的腹部，而在其产的卵中亦可检测到，表明螨类中也可能存在RNAi系统性传播。Campbell等(2011)使用0.9％NaCl溶液浸泡法，成功沉默了西方蜜蜂(Apis mellifera)的寄生性螨-狄氏瓦螨(Varroa destructor)的glutathioneS-transferase基因，其特异性沉默效率在转录水平上达到87％。本专利专利技术就是利用实验室改进的dsRNA干扰方法，从农业害螨中筛选出经干扰后能够导致叶螨死亡的重要基因，为建立利用RNA干扰技术控制害螨的新策略提供序列和数据基础。 
技术实现思路
本专利技术的目的是针农业害螨的危害，提供基于RNAi技术的抗虫制剂及抗虫方法 本专利技术的第一方面是提供该致死基因片段AK的dsRNA及其合成方法. 本专利技术的第一方面可通过如下技术方案实现： 农业害螨致死基因片段AK，序列如SEQ ID NO.1所示。 所述的叶螨致死基因片段AK的克隆方法，包括如下步骤： (1)取叶螨，提取总RNA，以提取的叶螨总RNA合成cDNA第一条链； (2)以步骤(1)合成的叶螨cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID NO.2的上游引物P1、序列为SEQ ID NO.3的下游引物P2进行RT-PCR扩增； (3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段； (4)将回收的目标DNA片段在T3连接酶作用下插入至PMD18-T载体中，转化到大肠杆菌Top-10，涂于含有Amp的LB培养基，37℃培养，过夜； (5)菌液PCR鉴定，筛选阳性重组子图1； (6)用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒； (7)全自动序列仪进行测序，得到SEQ ID NO.1所示的AK基因片段。 其中，所述的RT-PCR扩增体系为：10×Ex PCR Buffer2.5μL，2.5mM dNTP Mixture2.0μL，10μM上游引物P11.0μL，10μM下游引物P21.0μL，cDNA模板3μL，5U/μL Ex Taq0.25μL，ddH2O，15.25μL，共25μL；PCR反应程序为：94℃变性5min，94℃1min，56℃1min，72℃1min，32个循环，72℃延伸。 叶螨致死基因片段AK的dsRNA。 基于分析克隆获得的靶标基因功能区域，设计特异引物分别扩增获得正向双链DNA片段及反向双链DNA片段；使用体外高效转录试剂盒(HiScribe RNAi Transcription Kit)对获得的两条双链DNA靶标片段进行体外转录、退火合成dsRNA，构建出特异dsRNA. 本专利技术的另一方面是提供重组质粒载体的构建及其dsRNA的表达 所述的重组质粒载体的构建由以下方法实现： (1)提取本专利技术第一方面中克隆的重组质粒PMD18-T-AK，用HindIII和Sac II进行双酶切，获得两个黏性末端。 (2)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段。 (3)同样用HindIII和Sac II对L4440质粒进行双酶切，获得与(1)相同的黏型末端。 (4)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段，作为载体。 (5)将(2)所得的目的片段与(4)所得的L4440质粒载体片段用T4DNA连接酶连接，转化 到大肠杆菌HT115中，涂于含有(Amp+Tet)的双抗LB平板，37℃培养，过夜； (6)挑取单菌落，接种于2ml LB培养基(Amp+Tet)，37℃过夜培养，抽提质粒并进行酶切鉴定。 选择鉴定正确菌液0.75ml并加入0.25ml 80％甘油，-80℃保存 本专利技术的另一方面是诱导大肠杆菌HT115进行dsRNA的表达。 将上述保存的含有L4440-AK质粒的HT115菌液以1∶100的体积接种于(Amp+Tet)双抗的2×YT培养基中，37℃、250rpm培养至OD595≈0.4. 加入无菌的IPTG至终浓度为0.4mM于上述菌液，在37℃、250rpm诱导4h。 鉴定诱导表达的dsRNA。 本专利技术的另一方面是提供几种叶螨的dsRNA干扰方法， 本专利技术另一方面叶螨dsRNA干扰第一种方法是玻片点滴法，具体步骤包括： (1)将双面胶带剪成2cm长，贴在载玻片一端 (2)选择健康的雌成螨，用小号毛笔轻轻挑起，将其背部粘在胶带上，注意不要粘住足、须肢及口器。 (3)每片粘30头，排成三排，然后把玻片放在干净无毒且湿润的托盘中，置于28±1℃下培养箱 (4)0.5h后在双目解剖镜下挑去不活泼和死亡个体并补足30头备用 (5)用规格2.5μL移液枪在体视显微镜下往每头虫体背面滴加适量dsRNA。 死亡标准：以小号毛笔轻轻触动螨体，附肢不动者为死亡。 本专利技术另一方面叶螨dsRNA干扰第二种方法是dsRNA双通管法，具体步骤包括： (1)在玻璃双通管一端先加一块Parafilm封口膜，然后将人工饲料加在其上，再往其上盖住另一块新的Parafilm封口膜。 (2)然后往双通管中放入所要试验的叶螨。 (3)最后再往玻璃双通管另一端再按第(1)步所述的方法进行操作。 (4)添加完毕，用针尖向两端的双层Parafilm封口膜上各刺20(视具体情况)个微孔，以便空气和水分流动； (5)将叶螨放在人工气候箱饲养，往玻璃管中央盖一块黑布，以使叶螨能去两端吸食人工饲料，每24h换一次含dsRNA的饲料。 其中，所述的dsRNA为所述的叶螨致本文档来自技高网...

【技术保护点】
叶螨致死基因片段AK，其特征在于序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.叶螨致死基因片段AK，其特征在于序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的叶螨致死基因片段AK的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取叶螨，提取总RNA，以提取的叶螨总RNA合成cDNA第一条链；
(2)以步骤(1)合成的叶螨cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID NO.2的上游引物P1、
序列为SEQ ID NO.3的下游引物P2进行RT-PCR扩增；
(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段；
(4)将回收的目标DNA片段在T3连接酶作用下插入至pMD18-T载体中，转化到大肠杆菌
HT115，涂于含有氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养，过夜；
(5)通过菌液PCR，筛选阳性重组子；
(6)用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；
(7)全自动序列仪进行测序，得到SEQ ID NO.1所示的AK基因片段。
3.根据权利要求2所述的叶螨致死基因片段AK的克隆方法，其特征在于所述的RT-PCR扩
增体系为：反应缓冲液5μL，Mg2+4μL，dNTP 4μL，cDNA模板2μL，上游引物
1μL，下游引物1μL，R-Tag酶0.5μL，ddH2O 32.5μL，共50μL；PCR反应程序为：94℃变
性2min，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环，72℃延伸。
4.重组质粒载体的构建及其dsRNA的表达，其特征包含以下步骤：
(1)将权利要求2中克隆的重组质粒PMD18-T-AK，用HindIII和SacII进行双酶切，获得两个黏
性末端。
(2)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段。
(3)同样用HindIII和Sac II对L4440质粒进行双酶切，获得与(1)相同的黏型末端。
(4)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段，作为载体。
(5)将(2)所得的目的片段与(4)所得的L4440质粒载体片段用T4DNA连接酶连接，转化到大肠
杆菌HT115中，涂于含有(Amp+Tet)的双抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵伊英，刘峰，汪小东，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65