一种新型下调miRNA-21表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种新型下调miRNA-21表达的方法，在miRBase数据库中检索出>miR-21-5p的序列：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’；其反义互补序列为：5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’，再与载体粘性末端互补连接，得到合成的正反义链；将合成的正反义链混合，95℃加热5分钟退火形成双链，将退火的双链DNA室温连接30分钟得到连接产物；取2-10μl连接产物转化100μl感受态细胞DH5α，涂LB平板，含50μg/ml壮观霉素，37℃孵育16小时，取6个阳性克隆，接种到含50μg/ml壮观霉素的LB培养基中，按天根质粒小提试剂盒方法抽提质粒。本发明专利技术的有益效果是可以长效、便捷下调miR-21的表达。

【技术实现步骤摘要】
-种新型下调miRNA-21表达的方法
本专利技术属于生物基因
，涉及。
技术介绍
微小RNA-21 (microRNA-21，miR-21)是miRNA家族中的成员之一，具有重要的生物 学功能。目前，通过改变miR-21的活性或表达，从而研究其生物学功能的方法主要有抑制 剂（Inhibitor)、拮抗剂（Antagomir)及慢病毒载体等。然而，这些方法存在有效作用时间 短、操作困难、安全性能差等缺点，难以达到长效、便捷下调miR-21表达的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，解决了现有的改变 miRNA-21表达的方法有效作用时间短、操作困难的问题。 本专利技术所采用的技术方案是按照以下步骤进行： 步骤I :miR-21_AS0序列设计：在miRBase数据库中检索出〉miR-21_5p的序列： 5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3';其反义互补序列为：5' -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'，再 与载体粘性末端互补连接，得到合成的正反义链； 步骤2 :pcDNA-6. 2-miR-21-AS0载体构建：将合成的正反义链混合，95°C加热5分 钟退火形成双链，将退火的双链DNA室温连接30分钟得到连接产物； 步骤3 :取2-10 μ 1连接产物转化100 μ 1感受态细胞DH5 α，涂LB平板，含50 μ g/ ml壮观霉素，37°C孵育16小时，取6个阳性克隆，接种到含50 μ g/ml壮观霉素的LB培养基 中，按天根质粒小提试剂盒方法抽提质粒,重组质粒即为pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0。 本专利技术的有益效果是不仅可以长效、便捷下调miR-21的表达，同时还可快捷地观 察miR-21下调表达后的生物学效应。 【附图说明】 图1是本专利技术中miR-21-AS0序列的设计原理图； 图2是pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0真核表达载体构建示意图； 图3是该表达载体构建过程中的质粒电泳图和测序结果； 图4是该表达载体转染真核细胞后，miR-21表达水平检测； 图5是该表达载体转染真核细胞后，miR-21生物学效应检测。 【具体实施方式】 下面结合附图和【具体实施方式】对本专利技术进行详细说明。 本专利技术利用分子克隆及反义核酸技术构建含CMV启动子的 pcDNA-6. 2-miR-21-AS0真核表达载体。该载体体外转染真核细胞后，利用荧光定量PCR技 术检测miR-21的表达，同时通过体外实验观察miR-21下调后的生物学效应。本专利技术属于 生物
，可以广泛用于分子生物学和细胞生物学实验中下调miR-21，并观察其生物 学效应。 本专利技术采用以下步骤进行： 步骤I :miR-21_AS0序列设计：在miRBase数据库中检索出〉miR-21_5p的序列： 5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3';其反义互补序列为：5' -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'，再 与载体粘性末端互补连接，得到合成的正反义链。图1为miR-21-ASO序列的设计过程。 步骤2 :pcDNA-6. 2-miR-21-AS0载体构建：将合成的正反义链混合，95 °C 加热5分钟退火形成双链。将退火的双链DNA室温连接30分钟得到连接产物， pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0 的真核表达载体构建完成。图 2 为 pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0 真核 表达载体构建过程。其中，图中：SV40,猴空泡病毒40(Simianvirus 40) ;EGFP，增强型绿色 突光蛋白(Enhanced green fluorescent protein) ;Spec，壮观霉素抗性（Spectinomycin resistance) ;BSD，杀稻癌菌素抗性（Blasticidin resistance) ;Puc Ori,复制起始 位点（origin ofreplication) ;Pcmv，人巨细胞病毒启动子（Human cytomegalovirus promoter)〇 步骤3 :取2-10 μ 1连接产物转化100 μ 1感受态细胞DH5a，涂LB平板（含50 μ g/ ml壮观霉素）后，37°C孵育16小时。挑取6个阳性克隆，接种到含50 μ g/ml壮观霉素的LB 培养基中。按天根质粒小提试剂盒方法抽提质粒，重组质粒即为pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0。 将pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0送上海生物工程有限公司进行测序，并对测序结果 与目的序列进行Blast比对分析，如图3所示，A为重组质粒电泳图，B为重组质粒测序鉴定 示意图。用含10%胎牛血清、l〇〇〇u/mL青霉素、100ug/mL链霉素的McCoy'5A细胞培养液， 于37°C、C0 2体积分数为5%条件下培养HCT116细胞。将人结肠癌HCT116细胞分为阴性对 照组及 miRNA-21-AS0 实验组；分别作转染 pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR-Ctrl (p-Cont)阴性对 照质粒及pcDNA-6. 2-miR-21-AS0(p-miR-21AS0)质粒处理；收集转染72h后的细胞，提取总 RNA。利用Realtime PCR探针法检测miR-21的表达水平。结果显示：以U6作为内参，采用 2^ΔΔα方法计算miR-21相对表达水平，pcDNA-6. 2-miR-21-AS0转染组中，miR-21表达水平 明显下调（图4)，提示该载体可以显著下调miR-21的表达。 进一步检测了各转染组中HCT116细胞生长的变化。分组转染HCT116细胞72h后， 光镜下观察HCT116细胞的体外生长变化。结果发现与p-Cont转染组相比，p-miR-21AS0 转染组HCT116细胞的生长明显受到抑制，细胞数量减少，图5为该真核表达载体转染细胞 后，miR-21生物学效应检测图。图5A为光镜；图5B为CCK-8实验结果。结果表明，含CMV 启动子的p-miR-21-ASO真核表达载体不仅可以下调miR-21在真核细胞中的表达，同时，我 们也可通过体外转染观察miR-21下调表达后的生物学效应。 其中，miR-21 序列： 正义序列：5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA _ 3' ； miR-21-ASO 序列 正义链：5 ' -TGCTTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTG-3 '，反义链：5 ' -CCTGCAAAAATA GCTTATCAGACTGATGTTGA-3' ； 本专利技术的有益效果是，不仅可以长效、便捷下调miR-21的表达，同时还可快捷地 观察miR-21下调表达后的生物学效应。 以上所述仅是对本专利技术的较佳实施方式而已，并非对本专利技术作任何形式上的限 制，凡是依据本专利技术的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均 属于本专利技术技术方案的范围内。 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型下调miRNA‑21表达的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：步骤1：miR‑21‑ASO序列设计：在miRBase数据库中检索出>miR‑21‑5p的序列：5’‑UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA‑3’；其反义互补序列为：5’‑TCAACATCAGTCTGATAAGCTA‑3’，再与载体粘性末端互补连接，得到合成的正反义链；步骤2：pcDNA‑6.2‑miR‑21‑ASO载体构建：将合成的正反义链混合，95℃加热5分钟退火形成双链，将退火的双链DNA室温连接30分钟得到连接产物；步骤3：取2‑10μl连接产物转化100μl感受态细胞DH5α，涂LB平板，含50μg/ml壮观霉素，37℃孵育16小时，取6个阳性克隆，接种到含50μg/ml壮观霉素的LB培养基中，按天根质粒小提试剂盒方法抽提质粒，重组质粒即为pcDNA‑6.2‑miRNA‑21‑ASO。

【技术特征摘要】
1. 一种新型下调miRNA-21表达的方法，其特征在于，按照以下步骤进行： 步骤1 :miR-21_AS0序列设计：在miRBase数据库中检索出〉miR-21_5p的序列： 5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3';其反义互补序列为：5' -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'，再 与载体粘性末端互补连接，得到合成的正反义链； 步骤2 :pcDNA-6. 2-miR-21-AS0载...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐林，陶弋婧，周涯，郭萌萌，赵娟娟，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52