一种检测大肠杆菌的电化学传感器制造技术

本实用新型专利技术涉及传感器技术领域，特别涉及一种检测大肠杆菌的电化学传感器，从内到外依次为电极、普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物层、大肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层。制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中大肠杆菌的检测和生物传感器产业化的实际应用；可实现对食品中大肠杆菌的快速在线检测，检出限为3.4×10cfu mL-1。

【技术实现步骤摘要】
一种检测大肠杆菌的电化学传感器
本专利技术涉及传感器
，特别涉及一种检测大肠杆菌的电化学传感器。
技术介绍
大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，学名大肠希埃氏菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢，在自 然界中分布十分广泛，尤其是在温血动物的肠道和粪便中大量存在。自1885年埃斯克里奇 发现大肠杆菌以后，在此后相当长的一段时间内大肠杆菌一直被看做无害的非致病菌。随 着研宄的进展，人们根据菌体抗原的不同，将大肠杆菌分为150多型，大多属于肠道正常菌 丛，有16个为致病性大肠杆菌。大肠杆菌对外界环境中可生存一定时间，因而被粪便污染 的土壤、水源可能会含有致病性大肠杆菌。致病性大肠杆菌被婴儿和幼畜（禽）摄入后可导 致严重的腹泻和败血症，如非致病性大肠杆菌进入人体胆囊、膀胱等器官也可引起炎症。大 肠菌群值反映了食品等被粪便污染的程度，因而对食品、药品及饮用水中大肠杆菌菌群数 进行检测是十分必要的。 检测大肠杆菌的传统方法主要有三种，分别是多管发酵法、滤膜法和平板计数法， 这些方法有仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点。
技术实现思路
本研宄针对现有检测方法中仪器操作复杂，需要专业操作人员的缺点，提供了一 种检测大肠杆菌的电化学传感器。 本专利技术是通过以下步骤得到的： 一种检测大肠杆菌的电化学传感器，从内到外依次为电极、普鲁士蓝-碳纳米 管-纳米金复合物层、大肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层。 所述的电化学传感器，优选普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物层厚度为 90±5nm，大肠杆菌抗体层厚度为120±10nm，牛血清白蛋白封闭层厚度为100±10nm〇 所述的电化学传感器，优选普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物层是通过以下步 骤得到的： (1)多壁碳纳米管进行羧基化； (2)制备纳米金； (3 )使用步骤（1)和（2 )得到的产物制备普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物。 所述的电化学传感器，优选普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物中普鲁士蓝：碳纳 米管：金质量比为2:2:1。 所述的电化学传感器，优选 (1)电化学传感器用磷酸缓冲液冲洗之后，在E. coli溶液中孵育，再次用PBS冲 洗，干燥后在大肠杆菌菌液中孵育完全，干燥后滴加HRP标记的大肠杆菌抗体，HRP标记的 抗体通过与目标物之间的强识别能力，被修饰在电极表面； (2)采用三电极系统，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，修饰电极为 工作电极，以含对苯二酚和双氧水的PBS为工作底液采用差分脉冲伏安法检测，电位设置 为-0. 2到0. 6V，脉冲宽度0. 05V，脉冲宽度扫描为0. 06S，进行检测。 所述的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤： (1)制备普鲁士蓝_碳纳米管-纳米金复合物，滴加到经过处理的电极表面，室温 干燥，得到普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物层； (2)在普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物层上滴加无标记的大肠杆菌抗体，干 燥，得到大肠杆菌抗体层； (3)在大肠杆菌抗体层外包覆牛血清白蛋白，得到牛血清白蛋白封闭层。 所述的制备方法，优选普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物的制备方法如下： 1)多壁碳纳米管羧基化， 2)制备纳米金， 3)制备普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物。 所述的制备方法，优选多壁碳纳米管羧基化是通过以下步骤得到的： 称取200mg的多壁碳纳米管，加入160. 0mL的浓硫酸和浓硝酸的混合液中， 其中浓硫酸和浓硝酸的体积比为3 :1，混合均匀，离心，离心后倒去上清液加入去离子水水 洗，继续离心，直到上清液呈中性，干燥即得。 所述的制备方法，优选普鲁士蓝-碳纳米管_纳米金复合物是通过以下步骤得到 的： (1) 4mg羧基化的多壁碳纳米管分散到40.0mL0.01M的FeCU§液中； ( 2 )边搅拌边将40. 0mL0? 01M的K3Fe(CN) 6溶液逐滴加入步骤（1)得到的 FeClj§液中； (3)将步骤（2)得到的溶液在10000r/min条件下不断离心，倒去上清液，直到上 清液呈无色； (4)沉淀物经收集、干燥，分散到质量分数为0. 1 %的4. 0mL壳聚糖水溶液中，得 到修饰PB-CNTs的氨基基团； (5)在10000r/min条件下离心去除剩余壳聚糖； (6)将已完成氨基修饰的PB-CNTs加入金胶体中搅拌2均匀，离心分离即得。 所述的制备方法，优选牛血清白蛋白的浓度为0. 1%。 本专利技术的工作原理： 在金电极上首先修饰增效物质PB-CNTs-Au复合物，不但能促进电极表面电子转 移，而且增效物质之间的特殊基团的连接能保证它们的层层组装。金纳米粒子与捕获抗体 的氨基，通过Au_NH2的作用，把抗体修饰到电极上。然后，抗体与大肠杆菌有专一的识别能 力，大肠杆菌就能成功修饰到电极上。在大肠杆菌的另一端，HRP标记的大肠杆菌抗体通过 与目标物的特异性识别能力，也被成功修饰。在检测过程中，通过电极上的HRP催化检测底 液中的对苯二酚（HQ)和双氧水（H202)的氧化还原产生电信号，连接电化学工作站，以Ag/ AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为-0. 2到0. 6V，脉冲宽度0. 05V，脉冲宽 度扫描为〇. 06S，采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化，根据电极表面产生的电流的 大小起到对目标物检测的作用。电极上固定的HRP的量与修饰的被检测物大肠杆菌的量有 直接关系，被检测物越多，固定的HRP的量也越多，催化产生的电信号也越强。 本专利技术采用的PB-CNTs-Au复合物导电性强，成为构建传感器的优良材料；使用辣 根过氧化物酶（HRP)，通过与H202和HQ的反应，放大信号；采用了夹心型的检测模型，分别 在检测物E.coli的两端引入抗体，检测更为灵敏；制备的传感器灵敏度高，检测速度快；检 测E.coli的方法，操作简单、快速、灵敏，便于现场检测。 本专利技术的有益效果： 1、由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用； 2、反应层是使用表面修饰技术固定在工作电极上，优化使用材料的用量与浓度， 制得的夹心型电极对环境温度的要求不明显，室温下使用即可； 3、制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中大肠杆菌的检测 和生物传感器产业化的实际应用； 4、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求； 5、以金电极为固定载体固定基于PB-CNTs-Au复合物的夹心型电化学传感系统， 可实现对食品中大肠杆菌的快速在线检测，检出限为3. 4XlOcfumL' 【附图说明】 图1为本专利技术电化学传感器的制作流程图，右下角曲线图为该传感器在大肠杆菌 存在和不存在时分别产生的电流响应； 图2为实施例1检测结果图； 图3为实施例2检测结果图； 图4为实施例3检测结果图。 【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明： 首先制备普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物： 1)多壁碳纳米管羧基化， 2)制备纳米金， 3)制备普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物。 多壁碳纳米管羧基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测大肠杆菌的电化学传感器，其特征在于从内到外依次为电极、普鲁士蓝‑碳纳米管‑纳米金复合物层、大肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层。

【技术特征摘要】
1. 一种检测大肠杆菌的电化学传感器，其特征在于从内到外依次为电极、普鲁士 蓝-碳纳米管-纳米金复合物层、大肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层。2. 根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金 复合物层厚度为90±5nm，大肠杆菌抗体层厚度为120± 10nm，牛血清白蛋白封闭层厚度为 100± 10nm〇3. 根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复 合物层是通过以下步骤得到的： (1) 多壁碳纳米管进行羧基化； (2) 制备纳米金； (3 )使用步骤（1)和（2 )得到的产物制备普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物。4. 根据权利要求3所述的电化学传感器，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄加栋，郭玉娜，王玉，刘素，崔敏，李杰，徐伟，王虹智，许颖，崔杰，邱婷婷，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：新型
国别省市：山东;37