用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt制造技术

技术编号:11051782 阅读:239 留言:0更新日期:2015-02-18 16:23
本发明专利技术公开了一种用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt,该载体表达的丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt由组氨酸标签、口服免疫佐剂霍乱毒素B亚单位CTB和难治性丙型肝炎病毒基因型1的6个B细胞抗原表位Bp组成。为便于该疫苗在烟草高效表达,人工合成密码子优化的6His-CTBt-Bt基因,克隆至高效植物病毒表达载体马铃薯X病毒载体PVX201,获得丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt的重组表达载体PVX-6His-CTBt-Bt,该表达载体接种烟草,以烟草为反应器生产针对难治性丙型肝炎病毒的,易于纯化,有较好口服免疫效果和体外抗病毒感染的抗丙型肝炎病毒疫苗。

【技术实现步骤摘要】
用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt
本专利技术涉及抗病毒疫苗研发领域,尤其是涉及一种用于生产丙型肝炎(丙肝)病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt。
技术介绍
丙型肝炎病毒是丙型肝炎的致病因子,该病毒感染的世界总人数超过1.7亿,我国感染人数超过4000万。大多数丙型肝炎病毒感染者为持续性感染,进而引起慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。据报道,全球40%的慢性肝病和80%的肝细胞癌与丙型肝炎病毒有关,每年全球用于丙肝治疗费用超过1000亿美元。现有的治疗药物只对部分丙型肝炎肝病毒感染者有效,且治疗时间长,成本高和有副作用。疫苗是防治,特别是预防病毒性疾病的一种极其经济、简单和有效的手段。但是,至今还没有疫苗来预防和治疗丙型肝炎病毒感染。因此,研发具有自主知识产权的丙型肝炎病毒(特别是难治性丙型肝炎病毒)基因工程多表位疫苗具有极其重要的科学价值、无可估量的商业价值和社会效益。植物作为制备基因工程疫苗生物反应器具有生产成本低、安全性好、可口服、容易运输和保存等优点,因而成为近年来国际上疫苗研究和生产的一个热点和发展趋势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt。本专利技术的目的是这样实现的:(1)疫苗氨基酸组成设计:丙型肝炎肝病毒多表位疫苗氨基酸组成设计:从N端至C端依次为6个组氨酸(便于疫苗纯化),口服免疫佐剂霍乱毒素B亚单位CTB(增强疫苗口服免疫效果),难治性丙型肝炎病毒基因型1的6个B细胞中和抗原表位Bt(E1313-327aa-E2396-424aa-E2438-447aa-E2523-540aa-E2610-627aa-E2631-648aa)。各个抗原表位之间通过一个甘氨酸和一个丝氨酸残基隔开)。(2)疫苗密码子优化:为了促进疫苗基因在烟草的高表达,利用偏爱密码子在线分析软件http://www.bioinformatics.org/codon/cgi-bin/codon.cgi分析,合成6His-CTBt-Bt疫苗所需的优化密码子序列。(3)疫苗基因合成为了便于6His-CTBt-Bt疫苗基因的克隆和表达,对上述优化的丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt密码子序列,在其5’端引入ClaI酶切位点和烟草偏爱Kozak序列,3’端引入终止密码子和SalI酶切位点。使用在线分析软件http://helixweb.nih.gov/dnaworks/设计22条引物,PCR合成疫苗基因6His-CTBt-Bt。(4)疫苗表达载体构建及鉴定测序:PCR合成的6His-CTBt-Bt疫苗基因和马铃薯X病毒载体PVX201,使用ClaI和SalI双酶切,连接,获得疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt,对表达载体进行酶切和测序鉴定。(5)疫苗在烟草的表达和Westernblot鉴定:金刚砂磨损烟叶叶片,在磨损处接种疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt,同时以马铃薯X病毒PVX201(阴性对照)和PVX204(携带GFP基因接种烟叶作为对照,每个叶片接种病毒载体量为2-4μg。通过观察GFP蛋白表达验证、优化病毒接种和复制效果,制备烟草的蛋白提取物,分别使用鼠源的6×HisTag抗体(LanPower™)和CTB抗体(antibodies-onlineInc),Westernblot检测疫苗表达。Ni柱纯化表达的疫苗蛋白6His-CTBt-Bt。(6)动物实验测定疫苗的免疫特性和安全性:Ni柱纯化的疫苗蛋白口服免疫四周龄的BALB/c鼠三次(免疫时间为1,14和28天),每次每只鼠免疫10µg的疫苗蛋白。不含疫苗的烟叶蛋白提取物(10µg)免疫的鼠作为对照。实验组及对照组分别免疫三只鼠。不同时间取血,2倍系列稀释,ELISA测定不同时期(1,14,28,56和70天)抗体的滴度。阳性血清的OD值(490nm)大于阴性对照(疫苗免疫前的鼠血清和未进行疫苗免疫的鼠血清)OD值至少2倍的条件下,阳性血清的最大稀释度为此抗体的滴度。同时,疫苗免疫鼠前后,监测鼠体温和饮食,初步分析疫苗的安全性。(7)丙肝病人血清反应实验测定疫苗的人体内抗原性:ELISA测定30个随机选取的临床难治性丙型肝炎病毒(基因型1)病人血清(来自浙江省)与疫苗蛋白的反应性。20个随机选取的临床丙型肝炎病毒阴性血清(来自浙江省)作为阴性对照。阳性血清的OD值大于阴性对照OD值(20个丙型肝炎病毒阴性血清的平均值)2倍的条件下,判定疫苗蛋白与该阳性血清有反应性。(8)病毒进入抑制实验测定疫苗的病毒感染抑制效果:丙型肝炎病毒基因1型假病毒粒子(携带荧光素酶基因)用1mg/ml的疫苗蛋白或0.5mg/ml的CD81抗体(丙型肝炎病毒进入抑制的阳性对照)37度孵育2小时,然后,未孵育和孵育的假病毒粒子分别感染Huh7细胞。三天后,收获病毒感染的细胞,荧光素活性(病毒滴度的指示剂)实验测定每种细胞内的病毒滴度,确定疫苗对病毒感染的抑制效果。本专利技术依托已有的丙型肝炎病毒及其防治研究基础,基于烟草偏爱密码子和我国流行的难治性丙型肝炎病毒基因型1序列分析,利用马铃薯X病毒载体PVX201,通过分子生物学技术构建了用于生产难治性丙型肝炎病毒多表位疫苗的重组马铃薯X病毒表达载体PVX-6His-CTBt-Bt,该表达载体接种烟草,可生产具备免疫原性和体外抗型肝炎病毒感染的丙肝疫苗。丙型肝炎病毒疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt及丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt可用来生产预防性或治疗性的丙型肝炎病毒疫苗或生产丙型肝炎病毒诊断试剂盒。附图说明:图1:PVX-6His-CTBt-Bt载体的构建示意图,A:PVX-6His-CTBt-Bt载体示意图;B:ApaI/SaII酶切鉴定重组表达载体PVX-6His-CTBt-Bt;图2:疫苗在烟草的表达和鉴定示意图,A:PVX204和PVX201接种烟叶,12天后,制备烟叶蛋白提取物,Westernblot检测(;B:PVX-6His-CTBt-Bt和PVX201接种烟叶,12天后,制备蛋白提取物,分别使用6×HisTag抗体(上图)和CTB抗体(下图),Westernblot检测;图3:疫苗的纯化和免疫原性示意图,A:Ni柱纯化的疫苗蛋白6His-CTBt-Bt;B:丙肝疫苗6His-CTBt-Bt免疫鼠血清的抗体滴度,M1,M2和M3表示疫苗免疫的三只鼠;图4:疫苗与丙型肝炎病毒感染病人血清反应的示意图,ELISA测定丙肝疫苗与临床难治性丙型肝炎病毒(基因型1)感染病人血清反应性,临床丙型肝炎病毒阴性血清作为阴性对照。丙型肝炎病毒阳性血清的OD值大于阴性对照OD值(20个丙型肝炎病毒阴性血清的平均值)2倍的条件下,判定疫苗蛋白与该阳性血清有反应性;图5:疫苗体外抑制难治性丙型肝炎病毒(基因型1)的感染示意图,丙型肝炎病毒(基因型1)假病毒粒子用疫苗蛋白6His-CTBt-Bt,37度孵育2小时后感染Huh7细胞。3天后,收获细胞,测定荧光素酶活性(病毒粒子滴度的指示剂)。具体实施方式:下面结合附图和实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。实施例1PVX-6His本文档来自技高网...
用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt

【技术保护点】
丙型肝炎病毒疫苗表达载体PVX‑6His‑CTBt‑Bt及丙型肝炎病毒多表位疫苗6His‑CTBt‑Bt在制备丙型肝炎病毒疫苗中的应用。

【技术特征摘要】
1.丙型肝炎病毒疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt及丙型肝炎病毒多表位6His-CTBt-Bt在制备丙型肝炎病毒疫苗中的应用;所述丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt的氨基酸序列为:HisHisHisHisHisHisMetIleLysLeuLysPheGlyValPhePheThrValLeuLeuSerSerAlaTyrAlaHisGlyThrProGlnAsnIleThrAspLeuCysAlaGluTyrHisAsnThrGlnIleHisThrLeuAsnAspLysIlePheSerTyrThrGluSerLeuAlaGlyLysArgGluMetAlaIleIleThrPheLysAsnGlyAlaThrPheGlnValGluValProGlySerGlnHisIleAspSerGlnLysLysAlaIleGluArgMetLysAspThrLeuArgIleAlaTyrLeuThrGluAlaLysV...

【专利技术属性】
技术研发人员:孔令保黄明洁郭韫丽
申请(专利权)人:江西农业大学
类型:发明
国别省市:江西;36

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