类风湿性关节炎和其他自身免疫疾病的多重免疫试验制造技术

通过多重试验诊断类风湿性关节炎和其他自身免疫疾病，所述试验涉及针对一组抗原的抗体，所述抗原包括环化瓜氨酸化肽和至少五个来自列表的成员，所述列表包括BRAF1 506-525、BRAF2 656-675、瓜氨酸化波形蛋白(蛋白)、环化波形蛋白415-433cit、环化波形蛋白58-77cit3、环化凝聚素231-250cit sm1、环化血纤蛋白原A 556-575cit sm、环化血纤蛋白原A 616-635cit sm、环化组蛋白2A H2A/a1-20cit sm2、环化丝聚蛋白48-65cit2v1、BRAF(来自v raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1的催化结构域，氨基酸416-766)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】类风湿性关节炎和其他自身免疫疾病的多重免疫试验 相关专利申请的交叉参考 本申请要求2012年4月16日提交的美国临时专利申请号61/624,871 W及2013 年3月13日提交的美国专利申请号13/801，275的优先权，上述文献都通过引用纳入本文 W用于所有目的。 专利技术背景 1.
本专利技术涉及免疫诊断领域，特别感兴趣的是类风湿性关节炎。 2.现有技术说明 类风湿性关节炎是一种常见的自身免疫疾病，影响全世界0. 5-1 %的人口。该系统 性疾病的特征是滑膜关节的慢性炎症，导致软骨和骨破坏，并最终导致患者残疾。虽然类风 湿性关节炎不是威胁生命的疾病，但其可严重影响患者的生活质量。类风湿性关节炎的诊 断大多基于临床观察，但诊断中越来越多地使用特异性血清蛋白和血清学测试进行辅助。 通常用作该些测试祀标的生物标记物是类风湿因子、抗环化瓜氨酸化肤和C反应蛋白。 类风湿因子（R巧是用于描述一组自身抗体的术语，所述自身抗体独立称作类风 湿因子。RF测试被认为是对于自身免疫疾病类风湿性关节炎（RA)的基本筛选和标志。RF 被认为是早期标记，原因在于其存在与具有轻度关节炎症状的人中出现RA的风险升高相 关。类风湿因子包括立个亚组，其与免疫球蛋白G(IgG)的可结晶片段（Fe片段）反应W形 成处于关节和组织中的沉淀。 类风湿因子存在于患有类风湿性关节炎的患者中，但也存在于患有其他自身免疫 病症的患者中（如系统性红斑狼疮（SLE)、干燥综合征W及偶发性硬皮病和多肌炎的患者 中）。其也见于类风湿性关节炎重叠综合征中，如RA/SLE重叠和硬皮病/RA重叠。在其他 病症中W及不存在疾病的情况下（尤其是年龄增长时），RF测试也可能产生阳性结果。可导 致阳性RF测试结果的其他病症包括慢性活动性肝炎、结节病、慢性感染、多种癌症和梅毒。 针对瓜氨酸化蛋白的自身抗体（如抗CCP(环化瓜氨酸化肤）抗体）是针对类风 湿性关节炎的特异性血清标记。可在约50-60%的具有早期类风湿性关节炎的患者中检测 至IJ基线期的抗CCP抗体（在他们最初遇到专家时，通常是症状发生后的3-6个月）。参 见例如，Nell, V.，等，Art虹itis Res. Ther. 5 (增刊1) : 16 (2003)。对于不发展成为RA的 未分化的关节炎形式，抗CCP的特异性约为95-98%。IgM RF通常发现于同一患者中，但其 对RA的特异性低得多。使用抗CCP试验的一项研究显示，在关节炎的早期阶段中，当抗CCP 和IgM RF都是阳性时，对RA具有55 %的敏感性和97 %的特异性。参见例如，Jansen, A. L，等，J.化eumatol. 29:2074-6(2002)。另一项研究显示，首次就诊时的普遍程度甚至更 高一抗CCP抗体发现于70%的该类患者中。有趣的是，使用储存的样品发现，可在关节 炎开始前1. 5至9年时检测到抗CCP。参见例如，Rantapaa -D址Iqvist, S.,等,Art虹itis 化eum. 48:2741-9 (2003)。使用抗CCP试验的一项研究发现，跟踪3年后，抗CCP阳性患者 中93%存在从未分化多关节炎到RA的进展，但在抗CCP阴性患者中仅为25%。参见例如， ￥31163316]1,尸.4.,等，41'1：虹；[1：18 1?63.化61\5(增刊 1):28(2003)。数项观察表明，与没有 抗CCP的患者相比，早期RA患者中的抗CCP阳性结果可导致发生更糜烂性的疾病。
技术实现思路
现在已经发现，可使用来自人对象的生物样品分析针对抗原组的抗体，所述抗原 组不必然包括类风湿因子或CCP或上述两者，从而确定人对象是否患有类风湿性关节炎 (RA)或者患有类风湿性关节炎的对象中类风湿性关节炎的阶段或上述全部。然而，在许多 情况下，所述抗原组可包括CCP和选自特定列表的一种、二种、H种、四种或至少五种（例 女口，5、6、7、8、9、10种或全部）其他抗原。在本专利技术的某些实施方式中，所述特定列表是： (i) BRAFl 506-525 (SEQ ID NO: 1)， (U)BRAF2 656-675(SEQ ID N0:2)， (iii)瓜氨酸化波形蛋白（蛋白）（SEQ ID NO:3)， (iv)环化波形蛋白415-433cit(SEQ ID N0:4)，或环化瓜氨酸化变体结合的RA自 身抗体； (V)环化波形蛋白58-77cit3(SEQ ID N0:5)，或环化瓜氨酸化变体结合的RA自身 抗体； (￥1)环化凝聚素231-250。^31111669 10^:6)，或环化瓜氨酸化变体结合的^ 自身抗体； (Vii)环化纤维蛋白原A 556-575cit sm(SEQ ID N0:7)，或环化瓜氨酸化变体结 合的RA自身抗体； (viii)环化纤维蛋白原A 616-635citsm(SEQIDN0:8)，或环化瓜氨酸化变体结 合的RA自身抗体； (1义）环化组蛋白24肥4/3 1-20(3^31112 669 10^:9)，或环化瓜氨酸化变体结 合的RA自身抗体； [002。 （X)环化丝聚蛋白48-65cit2vl (SEQ ID NO: 10)，或环化瓜氨酸化变体结合的RA 自身抗体； (Xi)BRAF(来自V raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物Bl的催化结构域，氨基酸 416-766)(SEQ ID NO:11)。 在一些实施方式中，所述抗原组中的抗原是上述肤，例如使生物样品接触环化瓜 氨酸化肤和至少五种上述肤。 或者，在一些实施方式中，使生物样品接触多个肤，所述肤具有各环化瓜氨酸化肤 和至少五个成员的至少一种表位。对于另一种方法，应理解所述抗原组可相对于特定列表 选择性地包含额外的氨基酸或更少的氨基酸，前提是所述肤包含上述表位。因此，在一些 实施方式中，所述抗原还包括一个或多个氨基酸，所述氨基酸对于所述抗原是异源的，即不 是来自同一天然产生的蛋白。例如，在一些实施方式中，可将特定的肤连接至接头氨基酸 序列或天然条件下不与天然蛋白中抗原相邻的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗原 可包含来自天然产生的蛋白的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、10或更多个）其他天 然（非异源）氨基酸（例如，包含BRAFl 500-530的肤包含特定抗原BRAFl 506-525)。在 其他实施方式中，与上述肤相比，所述抗原可含有较少的氨基酸（少1、2、3、4、5、6、7、8、9或 更多个），前提是所述肤中保留至少一个祀标特异性抗原。作为一个实施例，可使用BRAFl 507-525 代替 BRAFl 日06-525。 [002引多种上文所列抗原（即iii-x)是瓜氨酸化的（cit、cit3等），即在天然的 精氨酸位置包含一个或多个（例如2、3、4、5、6、7、8或更多个）瓜氨酸。如下文序列部 分所示，可使用瓜氨酸取代多个精氨酸。所述抗原将包含至少一个瓜氨酸但可包含一个W 上。 此外，多种抗原（iv-x)表示为环化的。通过添加位于天然肤序列中的一对半脫氨 酸的方式使肤环化。在一些实施方式中，所述半脫氨酸位于肤的任一末端。该选项如下文 SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种确定人对象是否患有类风湿性关节炎或所患类风湿性关节炎所属阶段的方法，所述方法包括：(a)检测来自所述对象的生物样品中结合一组抗原中抗原的抗体的水平，所述抗原组包括环化瓜氨酸化肽和至少五个选自下组的成员：(i)BRAF1506‑525，(ii)BRAF2656‑675，(iii)瓜氨酸化波形蛋白(蛋白)，(iv)环化波形蛋白415‑433cit，以及(v)环化波形蛋白58‑77cit3，(vi)环化凝聚素231‑250cit sm1，(vii)环化血纤蛋白原A 556‑575cit sm，(viii)环化血纤蛋白原A 616‑635cit sm，(ix)环化组蛋白2A H2A/a 1‑20cit sm2(x)环化丝聚蛋白48‑65cit2v1，以及(xi)BRAF(来自v raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1的催化结构域，氨基酸416‑766)以及(b)将检测得到的所述水平与所述对象中类风湿性关节炎的存在、不存在或阶段相关联。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.16 US 61/624,871;2013.03.13 US 13/801,2751. 一种确定人对象是否患有类风湿性关节炎或所患类风湿性关节炎所属阶段的方法， 所述方法包括： (a) 检测来自所述对象的生物样品中结合一组抗原中抗原的抗体的水平，所述抗原组 包括环化瓜氨酸化肽和至少五个选自下组的成员： (i) BRAF1506-525, (ii) BRAF2656-675, (iii) 瓜氨酸化波形蛋白（蛋白）， (iv) 环化波形蛋白415-433cit,以及 (V)环化波形蛋白58-77cit3， (vi) 环化凝聚素 231_250cit sml， (vii) 环化血纤蛋白原A 556_575cit sm， (viii) 环化血纤蛋白原A 616_635cit sm， (ix) 环化组蛋白 2A H2A/a l-20cit sm2 (X)环化丝聚蛋白48_65cit2vl，以及 (xi)BRAF(来自v raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物BI的催化结构域，氨基酸416-766) 以及 (b) 将检测得到的所述水平与所述对象中类风湿性关节炎的存在、不存在或阶段相关 联。2. 如权利要求1所述的方法，所述方法包括使所述生物样品接触所述抗原组。3. 如权利要求1所述的方法，所述方法包括使所述生物样品接触多个肽，所述肽具有 环化瓜氨酸化肽和至少五个成员各自的至少一种表位。4. 如权利要求1所述的方法，其中步骤（a)包括： (1) 将所述样品与多个其上固定有所述抗原分子的固体支持物孵育，各所述固体支持 物上仅固定有所述抗原组的一种所述抗原分子并且所述固体支持物具有选定的区分参数， 使得具有所述抗原组中任一抗原的支持物都能够与具有所述抗原组中其他抗原的支持物 区分开来，并在特定条件下进行所述孵育，所述条件促进所述样品中可能存在的所述抗体 与固定在所述固体支持物上的所述抗原之间免疫结合； (2) 从所述样品中回收所述固体支持物； (3) 将回收得到的所述固体支持物与经标记的抗人抗体的溶液在特定条件下孵育，所 述条件促进所述固体支持物上可能存在的所述抗体与所述经标记的抗人抗体结合； (4) 从所述经标记的抗人抗体的溶液中回收所述固体支持物；以及 (5) 检测从所述经标记的抗人抗体的溶液中回收得到的所述固体支持物上连接的标 记，并将检测到的所述标记与所述区分参数相关联以获得分别代表所述样品中各所述抗体 水平的值。5. 如权利要求4所述的方法，所述固体支持物是珠，步骤（1)包括将所述样品与所述珠 的混合物在包含所述珠和所述样品的第一悬浮液中孵育，步骤（2)包括从所述第一悬浮液 中回收所述珠，步骤（3)包括将所述珠在包含所述珠和所述经标记的抗人抗体的溶液的第 二悬浮液中孵育，且步骤（4)包括从所述第二悬浮液中回收所述珠。6. 如权利要求5所述的方法，所述区分参数可通过流式细胞术区分，且步骤（5)包括通 过流式细胞术检测所述标记并分选所述珠。7. 如权利要求4所述的方法，所述经标记的抗人抗体是经标记的抗人IgG。8. 如权利要求4所述的方法，所述经标记的抗人抗体是经标记的抗人IgM。9. 如权利要求4所述的方法，所述经标记的抗人抗体是经标记的抗人IgA。10....

【专利技术属性】
技术研发人员：S·R·宾德，R·P·沃克，M·L·德兰诺伊，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US