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抗体-高分子结合体、其荧光衍生物及它们的制备方法技术

技术编号:10943456 阅读:124 留言:0更新日期:2015-01-22 20:06
抗体-高分子结合体、其荧光衍生物及它们的制备方法。所述抗体包含至少一个二硫键或自由的巯基,所述高分子通过连接到所述抗体的二硫键或自由的巯基而结合到所述抗体上。所述方法通过在抗体的特定位点进行修饰并原位生长高分子及其荧光衍生物;或者预先制备了高分子及其荧光衍生物,再与抗体的特定位点偶联制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物。本发明专利技术的方法简便高效,并且所制备产物不仅保留抗体原有的生物活性而且提高抗体的水溶性、稳定性、药代动力学、生物分布和治疗功效,并降低其免疫原性,此外本发明专利技术制备抗体-高分子荧光衍生物与传统方法制备的抗体-荧光标记物相比,具有更强的荧光信号和检测信号强度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域,具体地涉及抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的制备方法。
技术介绍
抗体作为生物体内最重要的一种免疫蛋白,已经广泛应用于生物医药显影、靶向治疗以及临床诊断等多个领域。单独使用抗体存在半衰期短、溶解性差等问题。将高分子与抗体相连制备抗体-高分子结合体,可以有效的提高抗体的溶解性、稳定性、药代动力学和治疗功效并降低其免疫原性。传统的抗体-高分子结合体的合成方法是将预先制备好的高分子与抗体相连,往往存在着偶联位点不确定、效率低、产率差、产物难以分离、质量控制差、活性难以保持(反应位点靠近抗体活性位点)等诸多难题。因此,迫切需要设计一种通用的方法,以有效的解决上述难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供高效、高产率的合成位点特异的抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的方法,用以提高抗体的溶解性、稳定性、药代动力学和治疗功效并降低其免疫原性。本专利技术提供了位点特异的抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的制备方法,所述抗体包含至少一个二硫键或自由的巯基,所述高分子通过连接到所述抗体的二硫键或自由的巯基而结合到所述抗体上。所述制备方法可包括两种:第一种为原位聚合法,所述方法包括:a1)制备抗体-引发剂的结合体,其中所述引发剂结合到所述抗体的二硫键或自由的巯基上;b1)所述抗体-引发剂结合体在缓冲液中与高分子单体或者与高分子单体以及荧光单体混合,在催化剂作用下引发所述高分子单体聚合而制备出所述抗体-高分子结合体或抗体-高分子结合体的荧光衍生物。优选地,在步骤a1)中,所述抗体的二硫键被还原成自由的巯基,然后所述引发剂连接到所述巯基上。原位聚合法通过在抗体的特定位点进行修饰并原位生长高分子,具有高效、高产率、高活性保持率特点。第二种为接枝法,接枝法预先制备了高分子,再与抗体的特定位点偶联制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物,所述方法包括:a2)引发剂在催化剂作用下引发高分子单体或者高分子单体以及荧光单体聚合,生成所述高分子或高分子的荧光衍生物;b2)所述高分子通过所述引发剂与所述抗体的二硫键或自由的巯基偶联,制备所述抗体-高分子结合体或抗体-高分子结合体的荧光衍生物。优选地,在步骤b2)中,所述抗体的二硫键被还原成自由的巯基,然后所述高分子通过所述引发剂连接到所述巯基上,制备出所述抗体-高分子结合体或抗体-高分子结合体的荧光衍生物。所述二硫键选自链内的二硫键、链间的二硫键中的至少一种。所述二硫键或巯基通过选自基因突变、引入非天然氨基酸、氧化还原、酶催化的化学或生物修饰方法引入。所述聚合可选自原子转移自由基聚合反应(ATRP)、可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)、开环异位聚合(ROMP)、开环加成聚合以及它们的组合。可以通过加入催化剂调控聚合。例如,用于引发ATRP聚合反应的催化剂包括但不限于铜离子及其配体(配体包括:二联吡啶及其衍生物配体、π受体衍生物配体、氮原子螯合配体以及一些脂肪多胺类配体);引发RAFT聚合反应的催化剂包括但不限于水溶性的自由基引发剂,如4,4’-偶氮(4-氰基戊酸)、2,2′-偶氮[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐、2,2′-偶氮[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]-无水焦硫酸盐、2,2′-偶氮(2-乙基丙脒)二盐酸盐等。引发ROMP聚合反应的催化剂包括但不限于水溶性的Grubbs催化剂等。所述聚合在低氧或者惰性气体氛围下进行,反应时间为5至48个小时,反应温度是0至80℃。所述引发剂可选自ATRP引发剂、RAFT引发剂、ROMP引发剂或和开环加成聚合的引发剂。所述ATRP引发剂可为2-(2-(2-(3,4-二溴代马来酰亚胺-N-乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基2-溴代-2-甲基丙酸酯(DBEB)。所述引发剂分子可以是化学式1、化学式2或化学式3的至少一个:所述化学式1中,R1为能够引发ATRP、RAFT或ROMP等聚合反应的官能团及其官能团衍生物。例如能够引发ATRP反应的官能团包括但不限于:N-(2-氨乙基)-2-溴代-2-甲基丙酰胺、N-(2-氨乙基)-2-氯代-2-甲基丙酰胺、2-溴代-N-(2-(2-肼基乙酰氨基)乙基)-2-甲基丙酰胺、2-氯代-N-(2-(2-肼基乙酰氨基)乙基)-2-甲基丙酰胺等。能够引发RAFT反应的官能团包括但不限于:R’C(=S)SR,其中R基团可以是半胱氨酸、肼、羟胺;R’基团可以是苯基、烷基、酞酰亚氨甲基;以及能够同时引发ROMP反应的官能团包括但不限于A-B型官能团,A可以是半胱氨酸、肼、羟胺,B可以是烯烃。R2和R3可以是但不限于H、I、Br、Cl、C6H5S、CH3C6H5S、Ts等容易被亲核取代的官能团及其官能团衍生物;R2和R3可以相同也可以不同;X和Y可以是但不限于NH、O、S、Se等原子,X和Y可以相同也可以不同,Z包括但不限于N或者CH。所述化学式2中,R1为能够引发ATRP、RAFT或ROMP等聚合反应的官能团及其官能团衍生物。例如能够引发ATRP反应的官能团包括但不限于:N-(2-氨乙基)-2-溴代-2-甲基丙酰胺、N-(2-氨乙基)-2-氯代-2-甲基丙酰胺、2-溴代-N-(2-(2-肼基乙酰氨基)乙基)-2-甲基丙酰胺、2-氯代-N-(2-(2-肼基乙酰氨基)乙基)-2-甲基丙酰胺等。能够引发RAFT反应的官能团包括但不限于:R’C(=S)SR,其中R基团可以是半胱氨酸、肼、羟胺;R’基团可以是苯基、烷基、酞酰亚氨甲基;以及能够同时引发ROMP反应的官能团包括但不限于A-B型官能团,A可以是半胱氨酸、肼、羟胺,B可以是烯烃。R2和R3可以是但不限于I、Br、Cl、C6H5S、CH3C6H5S、对甲苯环磺酰基的至少一种,R2和R3不能同时为H;X可以是但不限于NH、O、S、Se等原子。所述化学式3中,R1为能够引发ATRP、RAFT或ROMP等聚合反应的官能团及其衍生物。例如能够引发ATRP反应的官能团包括但不限于:N-(2-氨乙基)-2-溴代-2-甲基丙酰胺、N-(2-氨乙基)-2-氯代-2-甲基丙酰胺、2-溴代-N-(2-(2-肼基乙酰氨基)乙基)-2-甲基丙酰胺、2-氯代-N-(2-(2-肼基乙酰氨基)乙基)-2-甲基丙酰胺等。能够引发RAFT反应的官能团包括但不限于:R’C(=S)SR,其中R基团可以是半胱氨酸,肼,羟胺;R’基团可以是苯基、烷基、酞酰亚氨甲基;以及能够同时引发ROMP反应的官能团包括但不限于A-B型官能团,A可以是半胱氨酸、肼、羟胺,B可以是烯烃。R2可以是但不限于H、I、Br、Cl、C6H5S、CH3C6本文档来自技高网...
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【技术保护点】
一种制备抗体‑高分子结合体及其荧光衍生物的方法,其中,所述抗体包含至少一个二硫键或自由的巯基,所述高分子通过连接到所述抗体的二硫键或自由的巯基而结合到所述抗体上。

【技术特征摘要】
1.一种制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的方法,其中,所述抗体包含至
少一个二硫键或自由的巯基,所述高分子通过连接到所述抗体的二硫键或自由的巯基
而结合到所述抗体上。
2.如权利要求1所述的制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的方法,所述方
法包括:
a1)制备抗体-引发剂的结合体,其中所述引发剂结合到所述抗体的二硫键或自由
的巯基上;
b1)所述抗体-引发剂结合体在缓冲液中与高分子单体或者与高分子单体以及荧光
单体混合,在催化剂作用下引发所述高分子单体聚合而制备出所述抗体-高分子结合体
或抗体-高分子结合体的荧光衍生物,
在优选的步骤a1)中,所述抗体的二硫键被还原成自由的巯基,然后所述引发剂
连接到所述巯基上。
3.如权利要求1所述的制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的方法,所述方
法包括:
a2)引发剂在催化剂作用下引发高分子单体或者高分子单体以及荧光单体聚合,
生成所述高分子或高分子的荧光衍生物;
b2)所述高分子通过所述引发剂与所述抗体的二硫键或自由的巯基偶联,制备所
述抗体-高分子结合体或抗体-高分子结合体的荧光衍生物,
在优选的步骤b2)中,所述抗体的二硫键被还原成自由的巯基,然后所述高分子
通过所述引发剂连接到所述巯基上,制备出所述抗体-高分子结合体或抗体-高分子结
合体的荧光衍生物。
4.如权利要求1至3的任一项所述的制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的
方法,其中,所述二硫键选自链内的二硫键、链间的二硫键中的至少一种。
5.如权利要求1至3的任一项所述的制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的
方法,其中,所述抗体包含通过选自基因突变、引入非天然氨基酸、氧化还原、酶催
化的化学或生物修饰方法引入的所述二硫键或自由的巯基。
6.如权利要求2或3所述的制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的方法,其
中,所述聚合选自原子转移自由基聚合反应、可逆加成-断裂链转移聚合反应、开环异
位聚合反应、开环加成聚合中的一种。
7.如权利要求6所述的制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的方法,其中,

\t用于引发所述原子转移自由基聚合反应的催化剂选自铜离子、二联吡啶及其衍生物配
体、π受体衍生物配体、氮原子螯合配体以及脂肪多胺类配体的至少一种。
8.如权利要求6所述的制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的方法,其中,
用于引发所述可逆加成-断裂链转移聚合反应的催化剂选自水溶性的自由基引发剂,优
选地,所述水溶性的自由基引发剂选自4,4’-偶氮(4-氰基戊酸)、2,2′-偶氮[2-(2-咪唑啉
-2-基)丙烷]二盐酸盐、2,2′-偶氮[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]-无水焦硫酸盐、2,2′-偶氮(2-乙
基丙脒)二盐酸盐的至少一种。
9.如权利要求6所述的制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的方法,其中,
用于引发所述开环异位聚合的催化剂选自水溶性的Grubbs催化剂。
10.如权利要求2或3所述的制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的方法,其
中,所述聚合在低氧或者惰性气体氛围下进行,反应时间为5至48个小时,反应温度
是0至80℃。
11.如权利要求2或3所述的制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的方法,其
中,所述引发剂选自用于原子转移自由基聚合反应的引发剂、用于可逆加成-断裂链转
移聚合的引发剂、用于开环异位聚合的引发剂和用于开环加成聚合的引发剂。
12.如权利要求11所述的制备抗体-高分子结合体及其荧光衍生物的方法,其中,
所述用于原子转移自由基聚合反应的引发剂为2-(2-(2-(3,4-二溴代马来酰亚胺-N-乙氧
基)乙氧基)乙氧基)乙基2-溴代-2-甲基丙酸酯。
13.如权利要求2或3所述的制备的抗体-高分子...

【专利技术属性】
技术研发人员:高卫平张立彬
申请(专利权)人:清华大学
类型:发明
国别省市:北京;11

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