一种植物甾醇的检测分析方法技术

本发明专利技术涉及一种植物甾醇的检测分析方法，该方法首次使用衍生化试剂4’-羧基罗丹明对植物甾醇进行衍生化，并利用多反应监测模式的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱进行定性定量检测分析。该方法步骤为：首先利用超声辅助-分散液液微萃取技术提取植物甾醇，然后向所得植物甾醇萃取物中加入4’-羧基罗丹明乙腈溶液，2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和4-二甲氨基吡啶乙腈溶液，进行衍生化反应，最后通过超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。该方法温和快速、灵敏度高，对于富含植物甾醇的植物油、饮料、药材的质量控制具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种植物皆醇的检测分析方法
本专利技术涉及，尤其是涉及一种利用4' -羧基罗丹明 进行衍生化的植物甾醇的检测分析方法。
技术介绍
植物留醇（Phytosterol)是以环戊烷全氢菲为骨架的一类物质，主要存在于植物 的根、莖、B十、果实和种子中。近年来的研究表明，植物留醇的营养价值高、生理活性强，具有 降低血液胆固醇水平、防治冠状动脉粥样硬化、抗氧化、抗癌等药用和保健功能，在医学、食 品、化妆品等领域引起广泛关注。 但植物留醇分子缺少一个发色团或者质谱响应灵敏的分子部件，因此对于传统的 紫外-可见、荧光及质谱检测的灵敏度都很低，难以进行检测。在这种情况下，使用衍生化 技术提高灵敏度是一个很好的解决办法。中国专利（CN102967647A)公开了一种利用吡啶或 氘代吡啶作为衍生试剂、三氟甲磺酸酐作为催化剂，通过电喷雾离子化-四极杆-飞行时间 串联质谱对食用油中的甾醇类化合物的分析检测，提高了留醇类化合物的检测灵敏度，但 是该方法所采用的衍生试剂具有恶臭且强烈的刺激性，催化剂三氟甲磺酸酐具有强烈刺激 性气味，环境不友好，对人体危害大，且衍生反应前需要进行提取后皂化处理，反应条件苛 亥IJ、过程繁琐，检测物质为特定的样品；中国专利（CN102978272A )利用多元有机酸或酸酐 在催化剂作用下合成了植物留醇多元酸单酯，但该方法反应时间长达6-72小时，反应温度 高，能耗大。因此，利用环境友好的衍生化试剂，建立一种衍生化反应条件温和、简单快速、 灵敏度高的测定植物留醇的检测分析方法，对于食品和药品品质的评价具有十分重要的意 义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种利用环境友好的衍生化试 齐?，条件温和、简单快速、灵敏度高且适用性好的植物留醇的检测分析方法。 本专利技术的技术方案为： 本专利技术提供了一种植物留醇的检测分析方法，其特征在于：所述的植物留醇在催化剂 2-氯-1-甲基碘代吡啶（CMPI)和4-二甲氨基吡啶（DMAP)作用下，通过与衍生剂4'-羧基 罗丹明（CSR)进行衍生化反应，得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重 四极杆串联质谱系统进行分析检测。 所述的检测分析方法是通过以下步骤进行： a.超声辅助-分散液液微萃取技术提取植物留醇：取50-50〇μ?植物留醇样品溶液，力口 水定容至2-5 mL，调节pH为5_7,加入50-300μ?的萃取剂和250-80〇μ?的分散剂，超声波 振荡萃取，离心分离，所得沉积相用氮气吹千后溶于适量乙腈，得到植物留醇萃取物； 所述的萃取剂为二氯甲烷，三氯甲烷，三氯乙烯，四氯乙烯或氯苯； 所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇； b_衍生化反应：向步骤a中的植物甾醇萃取物中加入衍生化试剂200-6〇〇μ?的4，-羧 基罗丹明乙腈溶液，l〇〇-3〇〇ML2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和100-300 4-二甲氨基 批陡乙腈溶液，密封后摇勻，置于40-60°C水浴中反应15-40分钟，得到衍生化产物； c.将步骤c中的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统 进行定性定量分析检测。 所述的三氯甲烷，丙酮等化学试剂为分析纯，乙腈为高效液相色谱纯。 所述的植物留醇样品溶液为富含植物留醇的植物油、饮料、药材等实际样品。 所述的步骤a超声辅助-分散液液微萃取技术中，超声波震荡萃取时间为2分钟， 离心3 min，转速为10000 r/m。 上述的超声辅助-分散液液微萃取技术，优化的萃取剂为三氯甲烷，优化的分散 剂为甲醇。 所述的目标分析物植物甾醇是游离的豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇或 麦角甾醇。 所述的衍生化试剂4' -羧基罗丹明按照2012年Cardoso等报道的合成方法执行 (European Journal of Organic Chemistry, 2012，29，5810 - 5817)，经样品纯化和谱学 表征对比后表明合成的4' -羧基罗丹明结构正确。采用高效液相色谱-二极管阵列检测 器检测用于监控合成反应进程，经过三次微波辅助反应处理(每次15 min)即可获得最高收 率。粗产品采用半制备液相色谱法进行纯化，得到纯度为99%的CSR，产率48%。 所述的步骤b中的4' -羧基罗丹明乙腈溶液的摩尔浓度为lXl〇-4m〇l/L。 所述2-氯-1-甲基碘代吡啶（CMPI)溶于乙腈中制成质量浓度为1-10%的溶液， 2-氯-1-甲基碘代吡啶的摩尔数为4'-羧基罗丹明的500-10000倍，更优选的为7500倍。 所述的4-二甲氨基吡啶（DMAP)溶于乙腈中制成质量浓度为10-25%的溶液，4-二 甲氨基吡啶的摩尔数为4' -羧基罗丹明的100-1000倍，更优选的为490倍。 所述的步骤b中衍生化反应优化的条件为；置于45°C水浴中反应30分钟。 所述的步骤c衍生化产物经〇. 45 Mm滤膜过滤后用超高效液相色谱三重四极杆质 谱系统进行定性定量分析检测。 上述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统由安捷伦1290系列超高效液相 色谱，配备安捷伦6460三重四极杆串联质谱系统组成。 上述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18 色谱柱：2.1 mm X 50 mm，1.8 μηι，进样体积为2 μ?，柱温30 ° C，采用梯度洗脱法。 上述的梯度洗脱法,时间为5分钟，流速为〇. 2 mL/min，流动相Α为5%乙腈水溶液 含有0. 1%甲酸，流动相B为乙腈含有〇· 1%甲酸，0 min流动相组成为50%A+50%B，5 min时 10%A+90%B。 所述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测时的质谱的优选 条件为：千燥气温度300 ° C，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280 ° C，流速 11 L/min，毛细管电压3. 5 kV。 所述的游离的豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇或麦角甾醇的结构式如 下：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物甾醇的检测分析方法，其特征在于：所述的植物甾醇在催化剂2‑氯‑1‑甲基碘代吡啶和4‑二甲氨基吡啶作用下，通过与衍生剂4’‑羧基罗丹明进行衍生化反应，得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。

【技术特征摘要】
1. 一种植物留醇的检测分析方法，其特征在于：所述的植物留醇在催化剂2-氯-1-甲 基碘代吡啶和4-二甲氨基吡啶作用下，通过与衍生剂4' -羧基罗丹明进行衍生化反应，得 到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检 测。2. 根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于：是通过以下步骤进行： a. 超声辅助-分散液液微萃取技术提取植物留醇：取5〇-50〇μ?植物留醇样品溶液，力口 水定容至2-5 mL，调节pH为5-7,加入50-300μ?的萃取剂和250-800μ?的分散剂，超声波 振荡萃取，离心分离，所得沉积相用氮气吹干，得到植物留醇萃取物； 所述的萃取剂为二氯甲烷，三氯甲烷，三氯乙烯，四氯乙烯或氯苯； 所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇； b. 衍生化反应：向步骤a中的植物留醇萃取物中加入200-600μ?4' -羧基罗丹明乙腈 溶液，100-300μ?2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和100-300μ?4-二甲氨基吡啶乙腈溶液， 密封后摇匀，置于40-60°C水浴中反应15-40分钟，得到衍生化产物； c. 将步骤c中的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统 进行定性定量分析检测。3. 根据权利要求2所述的检测分析方法，其特征在于：步骤a中所述的萃取剂为三氯 甲烷，分散剂为甲醇。4. 根据权利要求1-3任一项所述的检测分析方法，其特征在于：所述的植物留醇是游 离的豆甾醇、β_谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇或麦角甾醇。5. 根据权利要求2所述的检测分析...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱树芸，赵先恩，吕涛，尤进茂，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37