增强腺相关病毒载体功能的方法技术

本发明专利技术提供了一种在选定的腺相关病毒(AAV)序列中校正单现突变从而提高选定AAV的包装产量、转导效率和/或基因转移效率的方法。该方法包括改变亲代AAV衣壳中的一个或多个单现突变，使它们与用来比对的功能性AAV衣壳序列中相应位点上的氨基酸相一致。

【技术实现步骤摘要】
增强腺相关病毒载体功能的方法本申请是国际申请PCT/US2006/013375，国际申请日2006年4月7日，中国国家阶段申请号200680010566.6，名称“增强腺相关病毒载体功能的方法”的专利技术专利申请的分案申请。专利技术背景腺相关病毒(AAV)是细小病毒科(Parvovirus)家族的一个成员，它是小的无包膜、二十面体病毒，具有4.7千碱基(kb)到6kb的单链线性DNA基因组。由于该病毒是作为纯化的腺病毒原种的污染物被发现的，AAV指定为依赖病毒属(Dependovirus)。AAV的生命周期包括潜伏期(AAV基因组在感染后位点特异性整合入宿主染色体)，感染期(腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的基因组接着得到拯救、复制并包装入感染的病毒)。非致病性、宽宿主范围(包括非分裂细胞)感染性以及潜在的位点特异性染色体整合的特性使得AAV成为用于基因转移的有吸引力的工具。已经描述AAV载体用于治疗用和免疫原性分子的运载工具。迄今为止，已从人或非人灵长类(NHP)中分离了几种表征良好的不同AAV。最近，研究者描述了不同序列的大量AAV[G.Gao等人，ProcNatlAcadSciUSA，100(10):6081-6086(2003年5月13日)；US-2003-0138772-A1(2003年7月24日)]，并且将这些AAV表征为不同的血清型和分化体[G.Gao等人，J.Virol.，78(12):6381-6388(2004年6月)；国际专利公开号WO2005/033321]。已报道不同的AAV表现出不同的转染效率，也表现出对不同细胞或组织的趋性。想要得到用于向不同细胞类型递送异源分子的基于AAV的构建体。专利技术概述本专利技术提供了一种用于改善无功能和/或功能弱的AAV载体的方法。一方面，该方法提供了一种在选定的腺相关病毒(AAV)序列中校正单现突变(singleton)以提高选定AAV的包装产量、转导效率和/或基因转移效率的方法。该方法包括改变亲代AAV衣壳中的一个或多个单现突变使所述单现突变与用来比对的功能性AAV衣壳序列中对应位点的氨基酸相一致。另一方面，本专利技术提供了经修正的AAV序列，即除去一个或多个单现突变的序列。又一方面，本专利技术提供了具有根据本专利技术修正的AAV衣壳的AAV载体。下述专利技术详述容易地表现出本专利技术的其他方面和优点。附图简述图1显示经单现突变校正的AAV载体的体外293转导。在载体名称之后标明了单现突变的校正(如果存在的话)，数字表示突变的数目。图2A-2C显示用293细胞测定的AAV载体在感染复数范围为101到104的滴度，其中，图2A比较亲代rh.8和经单现突变校正的rh.8(rh.8R)，图2B比较亲代rh.37和经修正的rh.37，图2C比较AAV2和AAV8。作为对照，还给出了AAV2和AAV2/8eGFP表达载体的相似滴定的结果。Y轴表示以流式细胞计数法测定的eGFP阳性细胞百分比(％)。图3是AAV序列的系统发生树，显示了它们的系统发生关系和所属分化体。图4A-4L是AAV2[SEQIDNO:7]、cy.5[SEQIDNO:8]、rh.10[SEQIDNO:9]、rh.13[SEQIDNO:10]、AAV1[SEQIDNO:11]、AAV3[SEQIDNO:12]、AAV6[SEQIDNO:13]、AAV7[SEQIDNO:14]、AAV8[SEQIDNO:15]、hu.13[SEQIDNO:16]、hu.26[SEQIDNO:17]、hu.37[SEQIDNO:18]、hu.53[SEQIDNO:19]、rh.39[SEQIDNO:20]、rh.43[SEQIDNO:21]和rh.46[SEQIDNO:22]的衣壳蛋白(vp1)核酸序列的比对。图5A-5D是AAV2[SEQIDNO:23]、cy.5[SEQIDNO:24]、rh.10[SEQIDNO:25]、rh.13[SEQIDNO:26]、AAV1[SEQIDNO:27]、AAV3[SEQIDNO:28]、AAV6[SEQIDNO:29]、AAV7[SEQIDNO:30]、AAV8[SEQIDNO:31]、hu.13[SEQIDNO:32]、hu.26[SEQIDNO:33]、hu.37[SEQIDNO:34]、hu.53[SEQIDNO:35]、rh.39[SEQIDNO:36]、rh.43[SEQIDNO:37]和rh.46[SEQIDNO:38]的衣壳蛋白(vp1)氨基酸序列的比对。图6A-6B是rh.13[SEQIDNO:26]、rh.2[SEQIDNO:39]、rh.8[SEQIDNO:41]、hu.29[SEQIDNO:42]和rh.64[SEQIDNO:43]的衣壳蛋白(vp1)氨基酸序列的比对。专利技术详述本专利技术提供了一种改善AAV载体功能的方法。本专利技术尤其适合于改善衣壳含一个或多个单现突变的AAV载体的包装产量、转导效率和/或基因转移效率。本专利技术进一步提供了根据本专利技术的方法鉴定和制备的新AAV衣壳序列。本说明书与权利要求书使用的术语“包含/含有”和“包括”包括其他成分、元素、数值、步骤等等在内。相反，术语“由...组成”和其变体不包括其他成分、元素、数值、步骤等等在内。本专利技术的单现突变方法如本文中所用的术语“单现突变(singleton)”指在选定的(即亲代)AAV衣壳序列中的给定位点上的可变氨基酸。通过将亲代AAV衣壳序列与功能性AAV衣壳序列文库比对来确定可变氨基酸的存在。然后分析序列来确定亲代AAV衣壳中所有这样的可变氨基酸序列：功能性AAV文库中的AAV序列在此氨基酸位置完全保守。然后改变亲代AAV序列，将单现突变改变为经鉴定功能性AAV衣壳序列在该位点上的保守氨基酸。根据本专利技术，亲代AAV序列可能具有1-6、1-5、1-4、1-3或2个单现突变。亲代AAV序列也可能具有超过6个单现突变。一旦修正后，经修正的AAV衣壳可用于构建具有经修正衣壳的AAV载体。可使用本领域技术人员公知的技术来构建载体。根据本专利技术方法所选择的用于修正的AAV是想要与亲代AAV相比增强其下列三种功能特性之一或多种的AAV，所述的三种功能特性即：包装成具有选定AAV序列的衣壳的病毒粒子，提高转导效率或增加基因转移效率。例如，与密切相关的其他AAV相比，亲代AAV的特征可能在于具有较低的包装效率。在另一个实例中，与密切相关的AAV相比，亲代AAV可能具有较低的转导效率。在另一个实例中，与密切相关的AAV相比，亲代AAV可能具有较低的基因转移效率(即：体内递送靶分子的能力较低)。在其他的实例中，亲代AAV的上述各项功能都合格，但有待进一步提高其中一项或多项功能。因此，本专利技术提供了一种功能性AAV的文库，其中AVV的序列与选定的(亲代)AAV形成对照。适宜的是，该文库包含具有目标功能的AAV，该目标功能正是欲在选定亲代AAV实现的改善。换句话说，该功能性AAV文库的每一序列的特征在于具有目标水平的包装能力、目标水平的体外转导效率或目标水平的体内基因转移效率(即：在对象中向选定靶组织或细胞的递送能力)。组成文库的功能性AAV可分别具有这些功能性特征中的一种、两种或全部。本领域技术人员可容易地确定文库的其他目标功能。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腺相关病毒(AAV)载体，具有AAVrh32/33衣壳，所述衣壳具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，所述病毒载体携有编码基因产物的转基因，所述转基因受指导其在宿主细胞内表达的调控序列的调控。

【技术特征摘要】
2005.04.07 US 60/669,083;2005.11.04 US 60/733,4971.一种腺相关病毒载体，具有AAVrh32/33衣壳，所述衣壳的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，所述病毒载体携有编码基因产物的转基因，所述转基因受指导其在宿主细胞内表达的调控序列的调控。2.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，所述基因产物是免疫原或抗原。3.如权利要求1或2所述的腺相关病毒载体，所述基因产物源自病毒抗原或免疫原。4.如权利要求1至3中任一项所述的腺相关病毒载...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·范登伯格，G·高，J·M·威尔森，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚大学托管会，
类型：发明
国别省市：美国;US