一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体及其制备方法和应用，属于生物医药领域。本发明专利技术通过在合成的凝血酶核酸适配体中掺入化学式I和/或II所示的异胸苷，从而得到一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体，实验证明经过该方法修饰的人体凝血酶核酸适配体，能够更好地与凝血酶识别，结合力更强，且具有更强的抗凝效果，因此，有希望将此异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体制备成一种高效，高选择性，低毒副作用的抗凝血药物。

【技术实现步骤摘要】
一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种核酸适配体(aptamer)及其制备方法和应用，特别涉及一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体（TBA）及其制备方法和应用，所获得的产品能够用于疾病治疗特别是能够应用于制备抗凝药物中。本专利技术属于生物医药领域。
技术介绍
抗凝药物是指一类能够抑制血液凝固的药物总称。根据功能可分为以下三类：(1)阻止纤维蛋白形成的药物如：肝素(UFH)、低分子肝素(LMWH)和华法林(warfarin)；(2)促进纤维蛋白溶解的药物如：尿激酶、链激酶、降纤酶、阿替普酶等；(3)抗血小板药物如：阿司匹林、前列环素、双嘧达莫、氯吡格雷、阿那格雷登等。目前所指的抗凝药物主要是指能够阻止纤维蛋白形成的药物。抗凝药物被广泛用于血栓栓塞性疾病的预防和治疗，如脑卒中、房颤(AF)、急性冠脉综合征(ACS)、弥散性血管内凝血、肺栓塞(PE)、风心病换瓣术后、外科手术后静脉血栓栓塞症(VTE)、肿瘤、血液透析等。这些疾病均需要应用抗凝药物来防治血栓栓塞形成和/或复发。以静脉血栓栓塞(VTE)为例，其包括深静脉血栓(DVT)及肺动脉栓塞(PE)。是临床常见病，严重者可危及生命。据统计，美国每年新发深静脉血栓(DVT)病例约200万人，并发肺动脉栓塞(PE)约60万人，其中致死性肺动脉栓塞(PE)20万人，死亡约5万人，占人口总死亡原因的第三位，仅次于肿瘤及心肌梗死，而发展中国家每年约有3-6千万人发生深静脉血栓(DVT)。静脉血栓栓塞(VTE)发生与血流淤滞、血液高凝状态及血管壁损伤有关，主要见于创伤手术和长期制动或高凝的内科患者。静脉血栓栓塞(VTE)致残率与致死率高，并发大面积PE时可立即致命，约1／3患者遗留静脉炎综合征。目前常用的抗凝剂包括肝素、低分子肝素和华法林。它们预防和治疗血栓栓塞性疾病的效果已被众多的临床试验所证明而广泛用于临床实践。然而，这些药物或多或少具有明显的缺点，如药效学或药动学存在不可预测性，容易导致出血;需要实验室监测以调整剂量(如肝素、华法林);肝素诱导的血小板减少症及骨质疏松症;非胃肠道给药(如肝素、低分子肝素)等等。肝素是一种硫酸化的糖胺聚糖混合物，分子量为3-15kD。其被广泛应用于防治血栓栓塞性疾病、弥漫性血管内凝血的早期治疗及体外抗凝。通过增加抗凝血酶III(AT-III)与凝血酶的亲和力而发挥抗凝作用，体内外均有强大的抗凝作用，静推后立即起效，半衰期3-4h。普通肝素有其独特的优点：(1)起效快，可完全被鱼精蛋白中和，目前它仍是体外循环抗凝的首选；(2)通过非肾脏途径代谢，肾功能不全相对安全；(3)肝素可钝化IXa、XIa、XIIa因子，进而阻滞内源性凝血激活通路，故理论上，肝素对导管、支架、瓣膜抗凝效果更佳。肝素的缺点也很明显，由于其分子量不均一，与血浆蛋白的结合，及对x因子选择性差，导致其安全性差，抗凝效果不稳定；其次需依赖AT-III而起作用，在AT-III活性不足或缺乏的情况下作用受影响；另外还会导致肝素相关性血小板减少(HIT)、骨质疏松、嗜酸性粒细胞增多等副作用。低分子肝素是由肝素裂解和纯化后得到的低分子量肝素(相对分子质量2000～10000)组成的混合物。前者和比后者具有更好的药效学和药动学特性。目前绝大多数UFH的适应症可用LMWH取代，一般不需要监测来调整剂量。LMWH的主要不良反应有出血、注射部位淤点和淤斑等，一般不需特殊处理，LMWH减量即可，严重者可用拮抗剂鱼精蛋白中和。此外，LMWH也不能抑制已经与血块结合的凝血酶，仍有引起血小板减少和骨质疏松的危险，胃肠道外给药同样给患者带来不便。华法林是过去惟一的口服抗凝剂，目前仍是静脉血栓栓塞症(VET)一级和二级预防的标准治疗药物。华法林为香豆类口服抗凝剂，通过干扰肝脏合成依赖于维生素K的凝血因子(II，VII，IX，X)从而抑制血液凝固。华法林主要不良反应是出血，如皮肤出血、鼻衄、牙龈出血、胃肠道出血等，重者可有脑出血。需监测以调整剂量，一般INR(InternationalNormalizedRatio)2～3为宜，治疗窗口狭窄。起效慢，用药后20～30h显效，3～5天后达到最大抗凝效果。消除也慢，停药后抗凝作用可持续4～5天。华法林抗凝作用受食物因素影响，与其他药物有相互作用。在以上三中主要的抗凝药物中，低分子肝素是常见的治疗试剂，其活性高，特异性强。但由于其是一种大分子混合物，质量不易控制，由此导致其副作用也难以克服。能否开发一种质量可控，特异性强的大分子化合物用作抗凝剂成为一种新的药物研发思路。1992年R.F.Macaya,通过体外的SELLEX技术筛选得到的一个15个碱基长度的DNA单链，它能够特异性地与凝血酶结合抑制凝血酶的活性，因此被命名为凝血酶核酸适配体(thrombinbindingaptamer,TBA)。与传统的小分子药物相比，TBA的特异性性更好，选择性更强。与蛋白药物分子相比，除继承了大分子药物的高特异性外，核酸药物分子的分子量相对蛋白药物分子来说小得多。因此可以通过人工合成的办法合成核酸小分子药物，这样既可以保持其高特异性又可以通过严格的质量控制，控制产品质量，降低副反应发生的概率。核酸分子作为一种新兴的药物分子具有广泛的应用前景。核酸分子TBA能够高选择性高特异性地与凝血酶结合抑制凝血酶的活性。此外核酸是人体内自身产生的大分子物质，对人体毒副作用小，并可在人体内降解生产核苷核，而核苷酸又可以被人体重复吸收利用合成人体需要的DNA或者RNA。因此将TBA开发成一种新型的高选择性无副作用的药物分子具有远大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体及其制备方法和应用，本专利技术通过改变凝血酶进核酸适配体与靶标结合部分碱基的空间构象来增强与靶标的相互作用，从而达到提高核酸适配体与靶标作用的特异性及生物活性目的。具体的，本专利技术通过在合成的凝血酶核酸适配体中掺入化学式I和/或II所示的异胸苷，从而得到一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体，实验证明经过该方法修饰的人体凝血酶核酸适配体，能够更好地与凝血酶识别，结合力更强，且具有更强的抗凝效果，因此，有希望将此异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体制备成一种高效，高选择性，低毒副作用的抗凝血药物。本专利技术的一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体（TBA），其特征在于是通过在凝血酶核酸适配体正义链的3位、4位、7位、9位、12位或13位其中一位或者多位上掺入化学式I或化学式II所示的异胸苷，代替天然核苷在相应位置进行偶联得到的；其中，修饰前的凝血酶核酸适配体正义链的序列为：5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’。以上所述3位是指TBA正义链:5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’所示核苷酸序列中5’端开始第三个核苷酸，即“T”，其余位置以此类推。相比于天然核苷化合物，异胸苷的碱基由糖环的1’-位移至糖环的2’-位，化学式I所示的异胸苷为L-构型的异胸苷，化学式II所示的异胸苷为D-构型的异胸苷。在本专利技术中，更优选的，是通过在凝血酶核酸适配体正义链的3位、9位、12位掺入式I所示的异胸苷或在凝血酶核酸适配体正义链的7位掺入式II所示的异胸苷代替天然核苷在相应位置进行偶联本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体（TBA），其特征在于是通过在凝血酶核酸适配体正义链的3位、4位、7位、9位、12位或13位其中一位或者多位上掺入化学式I或化学式II所示的异胸苷，代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的；其中，修饰前的凝血酶核酸适配体正义链的序列为：5’‑GGT TGG TGT GGT TGG ‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体(TBA)，其特征在于是通过在凝血酶核酸适配体正义链的3位、9位、12位掺入式I所示的异胸苷或在凝血酶核酸适配体正义链的7位掺入式II所示的异胸苷，代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的；其中，修饰前的凝血酶核酸适配体正义链的序列为：5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’。2.根据权利要求1所述的异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体，其特征在于是通过在凝血酶核酸适配体正义链的12位掺入化学式I所示的异胸苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的。3.一种制备权利要求1或2所述的异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体的方法，其特征在于在凝血酶核酸适配体正义链的3位、9位、12位掺入式I所示的异胸苷或在凝血酶核酸适配体正义链的7位掺入式II所示的异胸苷，代替天然核苷在相应位置进行偶联；其中，修饰前的凝血酶核酸适配体正义链的序列为：5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在对凝血酶核酸适...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨振军，蔡报彬，李理宇，范鑫萌，武芸，张礼和，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11