本发明专利技术涉及一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，属于生物标志物检测领域；首先建立一个用来研究镉蓄积的毒性模型，利用得到的毒性模型检测重金属镉中毒的生物学方法，首先通过二维电泳筛选小鼠血清中表达差异蛋白；然后对筛选出的差异蛋白在小鼠肝脏mRNA水平相对表达量的测算。本发明专利技术的方法检测的是生物体内实际生理变化，能起到提前预防的作用；筛选出的小鼠血清中一些差异基因表达变化情况稳定、显著、灵敏度高的特点；在二维电泳筛选结果的基础上结合Realtime-PCR技术，在蛋白水平和RNA水平上对基因的表达进行检测，大大提高了检测的可靠性和灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法
本专利技术涉及一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，属于生物体镉中毒的生物标志物检测领域。背景知识近年来，随着我国采矿、冶炼、陶瓷、电镀、及电子工业的迅猛发展，使镉、砷、汞等有害重金属通过废水、废气、废渣大量排放到自然界中，对耕地等土壤环境造成污染，同时也通过地表进入水体，流入海洋，导致了水体的严重污染。2014年4月我国公布最新的土壤污染调查公报显示，约16％的土壤遭受污染，其中重金属镉的污染约占7％，在过去的20年内增加了一倍，且有继续增加的趋势。这些镉在生物体内不易分解排放，蓄积在生物体内损伤机体并且中毒后难以发现，严重的威胁到人类的健康问题。因此，重金属镉的污染已经引起了全社会的关注，也是国内外学者面临的重要研究命题之一。镉(Cd)的原子量为112.41，处于周期表ⅡB副族。镉溶于酸但不溶于碱，有Cd2+和Cd1+两种氧化态。镉对动植物的危害较大，被镉污染的空气对人体危害严重。在上个世纪五十年代，日本富山县出现的“痛痛病”事件就是由于当地的冶炼厂排放的镉物质污染了水体和土壤，通过食物进入人体，使镉在体内蓄积而中毒致病的，患者出现了腰、背、手、脚等关节刺痛，骨骼变形易骨折的现象。根据美国国立卫生研究院(NIH)有毒物质数据库(HSDB)公布的信息可知，体内的镉大部分集中在肝脏及肾脏中，在骨骼和肌肉中也有相当量积累。体内和体外实验表明镉可以导致染色体损伤，还会影响基因的表达以及信号传导，目前研究表明过量的镉可以增加乳腺癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌和肾癌的发生几率。世界卫生组织(WHO)的国际癌症研究所(IRAC)把镉列为人类已知的致癌物，美国环保局把镉列为B1组人类致癌物。我国也是镉污染的重灾区，近年来不断的出现镉污染、镉中毒的事件，自2011年以来，中国多地市场发现大米镉含量超过国家规定的标准，引起了食品卫生部门的高度重视，这些食物中的镉通过食物链进入牲畜，最终进入人体，危害人体健康。这也使得对镉的研究显得尤为重要。目前，世界各国也都十分重视重金属镉污染的检测和研究。现有检测镉的方法主要是通过化学反应以及紫外-可见光分光光度法、原子吸收光谱法等测定生物体中组织或者器官中镉的含量，对于哺乳动物主要是血液和尿液中镉的含量。但是镉在进入机体后经过血液进入肝脏，再进入肾脏，其会在器官中不断的迁移，所以在不同的时期、不同的器官中镉的含量都不稳定；在检测过程中还容易被外界环境污染，误差较大。另外，尿液中的β2-微球蛋白、尿α1-微球蛋白也是现有的检测镉中毒的一些指标，但是这些蛋白的变化都出现在肾脏受到损伤之后。因此这些传统的方法存在着操作麻烦费时、检出灵敏度低、特异性差和稳定性差的缺点，且不能及时的反应出生物体在镉诱导下生理、生化反应及代谢等方面的变化。本专利技术就是基于重金属镉对小鼠产生毒害的情况下，引起小鼠相关基因的变化而建立起来的一种快速、灵敏的人体镉中毒的有效检测方法，为镉中毒的防治提供了科学有效的检测依据。本专利技术通过二维电泳这种非偏好型的筛选差异蛋白的方法，在小鼠血清中发现了一组镉诱导表达变化的蛋白，经质谱鉴定得到8个蛋白，包括4个下调蛋白载脂蛋白A-Ⅳ(ApolipoproteinA-IV，妊娠带蛋白(Pregnancyzoneprotein)，载脂蛋白A-Ⅰ前体(ApolipoproteinA-Iprecursor)，视黄醇结合蛋白(Retinol-bindingprotein)和4个上调蛋白淀粉体P成分前体(amyloidP-componentprecursor)，载脂蛋白E(ApolipoproteinE)，载脂蛋白C-Ⅲ前体(ApolipoproteinC-IIIprecursor)，载脂蛋白A-Ⅱ(ApolipoproteinA-II)。这组蛋白的变化或者其中某些蛋白的变化可以反应体内镉的情况，被认为可以作为检测机体内镉的生物标志物。这类标志物能实际的反映生物体在镉胁迫下其生理、生化反应及代谢等方面的变化，这种变化常早于重金属在生物体积累产生的毒害作用，且样品容易获取，能起到提前防治的作用。另外，利用血清中表达差异的蛋白作为重金属镉检测指标的研究还比较少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服传统检测手段中存在的缺点和不足，提供一种快速、灵敏、高效的生物体重金属镉的分子生物学检测方法。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术法案如下：(1)建立一个用来研究镉蓄积的毒性模型：将不同浓度的镉加入小鼠食物，根据小鼠的存活率确定致死剂量；然后在远低于致死剂量的前提下，选取一个安全的镉剂量作为研究对象。(2)利用步骤(1)得到的毒性模型检测重金属镉中毒的生物学方法，具体步骤如下：A.通过二维电泳筛选小鼠血清中表达差异蛋白：A-1.小鼠血清和肝脏组织的的获取：通过眼球取血的方法获取试验小鼠的全血，静置离心得到小鼠血清；然后解剖小鼠，获取肝脏组织。A-2.血清蛋白中差异蛋白的筛选：去除血清白蛋白，测定蛋白浓度后，通过二维电泳(2-DE)筛选出生物体内蓄积镉诱导的差异蛋白。A-3.差异蛋白的鉴定：抠取二维电泳胶上的蛋白点，质谱鉴定差异蛋白。B.筛选出的差异蛋白在小鼠肝脏mRNA水平相对表达量的测算：为了确保二维电泳筛选出的差异蛋白表达变化的结果的准确性，进一步从mRNA水平上验证这些蛋白的表达变化情况。由于镉通过血液首先进入肝脏，血液和肝脏中的变化很相似，且肝脏RNA容易提取，故选用小鼠肝脏验证差异蛋白在mRNA水平上的变化情况。B-1.提取小鼠肝脏总RNA。B-2.小鼠肝脏中差异蛋白基因表达量的测定：首先以小鼠肝脏总RNA为模板，通过RT-PCR合成cDNA第一链；然后以合成的cDNA为模版，根据差异基因的cDNA序列设计特异性引物和内参引物，进行Realtime-PCR反应，并得到每个基因的Ct值：最后根据PCR得到的Ct值，计算出筛选到的差异蛋白在小鼠肝脏中的相对表达量，利用下面公式计算：基因相对表达量＝2-ΔΔCtΔCt＝Ct(目的基因)-Ct(β-actin)ΔΔCt＝(Ct(目的基因)-Ct(β-actin))实验组-(Ct(目的基因)-Ct(β-actin))对照组2-ΔΔCt计算的结果即为差异基因相对于对照组的变化量，称为相对表达量。β-actin是管家基因，在所有类型的细胞中都有表达，受环境因素影响很小，具有比较稳定的表达，因此常用来作为测定目标基因表达量的参照基因。本专利技术中2-ΔΔCt数值变化越大，表明在镉的作用下该基因表达量变化越大，待测样品中镉含量就越大。其中，步骤A-3通过二维电泳这种非偏好型的筛选差异蛋白的方法，在小鼠血清中发现了一组镉诱导表达变化的蛋白，经质谱鉴定得到8个蛋白，包括4个下调蛋白：载脂蛋白A-Ⅳ(ApolipoproteinA-IV)，妊娠带蛋白(Pregnancyzoneprotein)，载脂蛋白A-Ⅰ前体(ApolipoproteinA-Iprecursor)，视黄醇结合蛋白(Retinol-bindingprotein)；4个上调蛋白：淀粉体P成分前体(amyloidP-componentprecursor)，载脂蛋白E(ApolipoproteinE)，载脂蛋白C-Ⅲ前体(Apolipoprotein本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：(1)建立一个用来研究镉蓄积的毒性模型： 将不同浓度的镉加入小鼠食物，根据小鼠的存活率确定致死剂量；然后在远低于致死剂量的前提下，选取一个安全的镉剂量作为研究对象；(2)利用步骤（1）得到的毒性模型检测重金属镉中毒的生物学方法，具体步骤如下：A. 通过二维电泳筛选小鼠血清中表达差异蛋白；B. 筛选出的差异蛋白在小鼠肝脏mRNA水平相对表达量的测算，其中差异蛋白相对表达量数值变化越大，表明在镉的作用下该基因表达量变化越大，待测样品中镉含量就越大。
【技术特征摘要】
1.一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：(1)建立一个用来研究镉蓄积的毒性模型：将不同浓度的镉加入小鼠食物，根据小鼠的存活率确定致死剂量；然后在远低于致死剂量的前提下，选取一个安全的镉剂量作为研究对象；(2)利用步骤（1）得到的毒性模型检测重金属镉中毒的生物学方法，具体步骤如下：A.通过二维电泳筛选小鼠血清中表达差异蛋白；B.筛选出的差异蛋白在小鼠肝脏mRNA水平相对表达量的测算，其中差异蛋白基因的相对表达量数值变化越大，表明在镉的作用下该基因表达量变化越大，待测样品中镉含量就越大。2.根据权利要求1所述的一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，其特征在于，步骤A中所述通过二维电泳筛选小鼠血清中表达差异蛋白具体操作如下：A-1.小鼠血清和肝脏组织的的获取：通过眼球取血的方法获取试验小鼠的全血，静置离心得到小鼠血清；然后解剖小鼠，获取肝脏组织；A-2.血清蛋白中差异蛋白的筛选：去除血清白蛋白，测定蛋白浓度后，通过二维电泳筛选出生物体内蓄积镉诱导的差异蛋白；A-3.差异蛋白的鉴定：抠取二维电泳胶上的蛋白点，质谱鉴定差异蛋白。3.根据权利要求1所述的一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，其特征在于，步骤B中所述筛选出的差异蛋白在小鼠肝脏mRNA水平相对表达量的测算具体操作如下：B-1.提...
【专利技术属性】
技术研发人员：施海峰，刘海涛，周阳，屠志刚，张修文，袁啸，史美琳，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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