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蛋白质‑高分子结合体及其制备方法技术

技术编号:10812233 阅读:150 留言:0更新日期:2014-12-24 17:19
本发明专利技术公开了蛋白质‑高分子结合体及其制备方法,所述高分子通过连接到所述蛋白质的引发剂而结合到所述蛋白质上。所述引发剂可连接到所述蛋白质的N‑或C‑端以及其它远离蛋白质活性位点和/或不影响蛋白质活性的任何位置。这种方法制备的位点特异的干扰素‑高分子结合体不仅较好地保留了体外生物活性,而且极大地改善了干扰素在体内的半衰期、生物分布和抗肿瘤效果,从而为强效干扰素向临床转化打下坚实的技术基础。此外,这种原位定点聚合法也可广泛应用于其它的蛋白或小肽药物来提高其药理学特征。

【技术实现步骤摘要】
蛋白质-高分子结合体及其制备方法
本专利技术属于生物医药领域,具体涉及蛋白质-高分子结合体及其制备方法。
技术介绍
蛋白质(例如抗体)已经广泛应用于生物医药显影、靶向治疗以及临床诊断等多个领域。单独使用蛋白质存在半衰期短、溶解性差等问题。将蛋白质与高分子相连制备蛋白质-高分子结合体,可以有效的提高蛋白质的溶解性、稳定性、药代动力学和治疗功效并降低其免疫原性。传统的蛋白质-高分子结合体的合成方法是将预先制备好的高分子与蛋白质相连,往往存在着偶联位点不确定、效率低、产率差、产物难以分离、质量控制差、活性难以保持等诸多难题。因此,迫切需要设计一种通用的方法,以有效的解决上述难题。为解决上述问题,提出了一些蛋白修饰修饰方法,例如设计缓释给药系统,如制备脂质体和微球、白蛋白融合,基因突变引入对蛋白酶不敏感氨基酸等,但均存在一些问题。脂质体包封率低,突释和释放不完全产生不良反应,并且在制备过程强烈的物理、化学变化导致的蛋白变性失活。此外,白蛋白融合需在真核体系中表达,产率低,成本高。引入特殊氨基酸可能降低蛋白活性,并且无法解决肾脏的排空问题。干扰素-α2(IFN-α2)是病毒复制和肿瘤细胞生长的强效抑制剂,已被成功用于治疗病毒性肝炎和癌症等疾病。但是,IFN经系统注射给药后循环半衰期非常短,需要频繁给药且在高浓度下才能达到预期的疗效,从而导致一些毒副作用,同时给患者带来沉重的经济负担。用聚乙二醇(PEG)修饰IFN,是改善其药代动力学和提高其疗效的有效措施,被称为长效干扰素。然而,目前的PEG化干扰素存在如反应产率低、结合位点和偶联化学计量难以控制、生物活性严重降低等弊端。
技术实现思路
为了提高蛋白质-高分子结合体中蛋白质与高分子偶联的稳定性和效率,促进产物的分离、质量的控制和蛋白质活性的保持,本专利技术提供了一种制备蛋白质-高分子结合体的方法,其中,所述高分子通过连接到所述蛋白质的引发剂而结合到所述蛋白质上,其中,所述蛋白质选自医药、农业、科研以及其它工业领域相关的蛋白、小肽和抗体,优选粒细胞集落刺激因子、胰高血糖素样肽-1及其类似物或水蛭素。所述高分子连接到所述蛋白质的N-或C-端及其它任何远离所述蛋白质的活性的位点和/或不干扰所述蛋白质的活性的位点。例如,利用粒细胞集落刺激因子唯一不配对半胱氨酸Cys17与带有马来酰亚胺基团引发剂特异性反应,通过活性聚合原位生长高分子。通过基因工程手段在胰高血糖素样肽-1类似物C端引入半胱氨酸或非自然氨基酸与引发剂特异性结合并生长高分子。根据一个实施方式,所述方法可包括:a1)制备蛋白质-引发剂的结合体;b1)所述蛋白质-引发剂结合体在缓冲液中与高分子单体混合,在催化剂作用下引发所述高分子的单体聚合而制备出所述蛋白质-高分子结合体。根据另一个实施方式,所述方法可包括:a2)所述引发剂在催化剂作用下引发所述高分子单体的聚合,生成所述高分子;b2)所述高分子通过所述引发剂与所述蛋白偶联,制备所述蛋白质-高分子结合体。根据一个实施方式,通过选自基因突变、引入非天然氨基酸、氧化还原、酶催化、正交化学的化学或生物修饰方法在所述蛋白质上引入的引发剂的结合位点。根据一个实施方式,所述高分子由单体通过聚合反应生成,所述聚合反应可选自原子转移自由基聚合反应(ATRP)、可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)、开环异位聚合(ROMP)、开环加成聚合以及它们的组合。根据一个实施方式,引发所述原子转移自由基聚合反应的催化剂选自铜离子、二联吡啶及其衍生物配体、π受体衍生物配体、氮原子螯合配体以及脂肪多胺类配体。引发所述可逆加成-断裂链转移聚合反应的催化剂选自4,4′-偶氮(4-氰基戊酸)、2,2′-偶氮[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐、2,2′-偶氮[2-(2-咪唑啉-2-y1)丙烷]-无水焦硫酸盐、2,2′-偶氮(2-乙基丙脒)二盐酸盐的水溶性的自由基引发剂。引发所述开环异位聚合的催化剂选自水溶性的Grubbs催化剂。根据一个实施方式,所述聚合反应可在低氧或者惰性气体氛围下进行。所述聚合反应的反应时间可为5分钟至24小时,具体地,5、15、30、45、60分钟,或1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、24小时等。所述聚合反应的反应温度可为0~80℃,具体地0、4、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80℃等。根据一个实施方式,所述引发剂选自原子转移自由基聚合反应的引发剂、可逆加成-断裂链转移聚合的引发剂、开环异位聚合的引发剂和开环加成聚合的引发剂。所述原子转移自由基聚合反应的引发剂可为2-(2-(2-(3,4-二溴代马来酰亚胺-N-乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基2-溴代-2-甲基丙酸酯。所述原子转移自由基聚合反应的引发剂可含有选自N-(2-氨乙基)-2-溴代-2-甲基丙酰胺、N-(2-氨乙基)-2-氯代-2-甲基丙酰胺、2-溴代-N-(2-(2-肼基乙酰氨基)乙基)-2-甲基丙酰胺、2-氯代-N-(2-(2-肼基乙酰氨基)乙基)-2-甲基丙酰胺的官能团;所述可逆加成-断裂链转移聚合的引发剂可含有官能团ZC(=S)SR,其中R基团可以是半胱氨酸、肼、羟胺,Z基团选自苯基、烷基、酞酰亚氨甲基;所述开环异位聚合的引发剂可含有A-B型官能团,其中A为半胱氨酸、肼、羟胺,B为烯烃。根据一个实施方式,所述高分子由单体通过聚合反应生成,所述单体可选自乳酸、表氯醇、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、降冰片烯以及氧杂降冰片烯中的至少一种。所述单体具有化学式1至4的任一个表示的结构:其中,化学式1~4中的R基团选自烷基、苯基、苄基、羧甜菜碱基、磺酸甜菜碱基、寡聚乙二醇、聚乙二醇、优选地,所述烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基。所述单体可包括两种反应基团,这两种反应基团彼此反应形成所述高分子。所述单体可进一步包括一个或多个在发生聚合反应时嵌入到聚合物的骨架中的反应基团。所述单体可为水溶性或生物可降解的聚合物单体。所述蛋白质-高分子结合体中的高分子可包含均聚物、多杂聚合物、嵌段聚合物、共聚物、三元共聚物。所述高分子的侧链可包括内铵盐侧链、羧基内铵盐侧链、砜基内铵盐侧链、寡聚乙二醇侧链、聚乙二醇侧链。所述高分子可为POEGMA或PMPC等。本专利技术的另一个方面提供了一种通过上述方法制备的蛋白质-高分子结合体。所述蛋白质可为干扰素,所述干扰素可选自干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素λ。所述引发剂连接到所述干扰素的N-或C-端以及其它远离干扰素活性位点和/或不影响干扰素活性的任何位置。优选地,所述引发剂可连接到所述干扰素的C-端。本专利技术通过利用生物化学和高分子化学技术在干扰素的C-末端进行修饰并原位高效生长出位点特异和单修饰的干扰素-高分子结合体极大地提高了干扰素的稳定性、药物代谢动力学、生物分布和抗肿瘤功效。本专利技术提供了一种合成强效干扰素的方法。通过在远离IFN的活性位点如C-或N-末端、通过基因工程引入得半胱氨酸和非天然氨基酸等通过原子转移自由基聚合(ATRP)技术原位高效生长出POEGMA(聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)和PMPC(聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱),产生位点特异且等当量的蛋白质-高分子结合体(即IFN-POEGMA和IFN-PMPC)。这种位点特本文档来自技高网
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<a href="http://www.xjishu.com/zhuanli/26/201410478802.html" title="蛋白质‑高分子结合体及其制备方法原文来自X技术">蛋白质‑高分子结合体及其制备方法</a>

【技术保护点】
一种制备蛋白质‑高分子结合体的方法,其中,所述高分子通过连接到所述蛋白质的引发剂而结合到所述蛋白质上,其中,所述高分子连接到所述蛋白质的N‑或C‑端及其它任何远离所述蛋白质的活性的位点和/或不干扰所述蛋白质的活性的位点,所述蛋白质选自医药、农业、科研以及其它工业领域相关的蛋白、小肽和抗体,优选粒细胞集落刺激因子、胰高血糖素样肽‑1及其类似物或水蛭素。

【技术特征摘要】
1.一种制备蛋白质-PMPC结合体的方法,其中,所述方法包括:通过转肽酶A催化在蛋白质的C-末端引入引发剂,获得蛋白质-引发剂结合体;将所述蛋白质-引发剂结合体在缓冲液中与MPC单体混合,通过催化剂原位ATRP在蛋白质的C-末端合成PMPC,从而形成蛋白质-PMPC结合体,其中,所述PMPC通过连接到所述蛋白质的引发剂而结合到所述蛋白质上;所述蛋白质选自干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素λ,所述引发剂为2-(2-(2-(3,4-二溴代马来酰亚胺-N-乙氧基...

【专利技术属性】
技术研发人员:高卫平胡瑾王贵林
申请(专利权)人:清华大学
类型:发明
国别省市:北京;11

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