适配体方法技术

技术编号:10786509 阅读:91 留言:0更新日期:2014-12-17 13:19
本发明专利技术涉及一种新的用于确定样本中两个或多个分析物的组中的一个或多个分析物成员是否存在的方法。本发明专利技术由此还涉及用于确定多个分析物组中每个分析物是否存在的多重检测。该检测使用适配体和跨膜孔。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】适配体方法
本专利技术涉及一种新的确定样本中一组两个或多个分析物中的一个或多个成员是否存在的方法。因此本专利技术涉及一种用于确定一组多分析物中的每个分析物是否存在的多重检测法。该检测使用适配体和跨膜孔。
技术介绍
跨膜孔(纳米孔)作为多种分析物,例如聚合物和小分子的直接的电生物传感器,具有很大的潜力。当在纳米孔的两端施加电位时,当分子例如核苷酸或多核苷酸在纳米孔的桶状结构或通道中短暂停留一定时间,电流发生变化。特定的分子,如特定的核苷酸和特定的多核苷酸,给出具有已知识别特征和持续时间的电流变化。这类电流变化可以用于识别所述孔中核苷酸或多核苷酸的存在。
技术实现思路
本专利技术人已经证明,跨膜孔可以用在多重检测中来确定在两个或多个分析物的组中的每种分析物是否存在。更具体地,本专利技术人已经证明,可使用跨膜孔和含适配体的探针组来确定各分析物是否存在。通过探针组中的至少一个探针来识别每种感兴趣的分析物。每个探针还包括一个能够进入孔中并影响流经该孔的电流的尾部。每个尾部根据所述孔是否结合至所感兴趣的分析物之一而以不同的独特方式影响流经所述孔的电流。所述探针组中每个探针对流经所述孔的电流的影响也不相同,因此能够检测识别出每个探针。令人惊讶地,适配体和尾部的这种组合通过分析探针尾部对流经所述孔的电流的影响,可以将探针组中结合至感兴趣的分析物的一个或多个甚至全部的探针识别出。相应地,本专利技术提供了一种确定样本中含两个或多个分析物的组中的一个或多个分析物成员是否存在的方法,该方法包括:(a)使所述样本与跨膜孔和两个或多个探针的组相接触,其中,每个探针可识别所述分析物成员中的一个或多个并包括(i)适配体,其结合到所述分析物成员中的一个或多个,和(ii)尾部,其能够进入所述孔并根据探针中的所述适配体是否结合到分析物成员之一而对流经所述孔的电流具有不同影响,其中每个探针影响以独特的方式流经所述孔的电流,并且其中所述两个或多个分析物的组中的每个分析物成员被所述探针组中的至少一个探针认别;和(b)测量流经所述孔的电流,以确定——如果有的话——探针组中的哪些探针已经结合至分析物成员并由此确定样本中一个或多个分析物成员是否存在。本专利技术还提供了:-一种测定样本中两个或多个分析物的组中的一个或多个分析物成员浓度的方法,该方法包括:(i)实施本专利技术的方法;和(ii)针对显示存在于样本中的一个或多个分析物成员,在步骤(b)中将流经所述孔的电流与每个分析物成员的对照试验或参考数据进行比较,从而确定样本中所述一个或多个分析物成员的浓度;-用于确定样本中两个或多个分析物的组中的一个或多个分析物成员是否存在以及存在时的浓度的探针组,所述探针组包括两个或多个探针,其中,每个探针可识别一个或多个分析物成员并包括(i)适配体,其结合到一个或多个分析物成员和(ii)尾部,其能够进入跨膜孔并根据探针中的适配体是否结合到分析物成员之一而对流经所述跨膜孔的电流具有不同影响,其中每个探针影响以不同方式流经所述孔的电流,并且其中所述两个或多个分析物的组中的每个分析物成员被探针组中的至少一个探针认别;和-确定样本中两个或多个分析物的组中的一个或多个分析物成员是否存在以及存在时的浓度的试剂盒,所述试剂盒包括(a)本专利技术的探针组,和(b)跨膜孔;和-用于确定样本中两个或多个分析物的组中的一个或多个分析物成员是否存在以及存在时的浓度的分析装置,所述分析装置包括本专利技术的多个探针以及探针组。附图说明图1显示了在不存在(a)和存在(b)结合分析物的情况下纳米孔内探针配置的示意代表图。对应不存在(c)和存在(d)结合分析物情况的预期事件迹线展示如下(对于(c)和(d),y轴=电流,x轴=时间)。虚线表示聚合(dA)区域,十字线区域(crossregion)表示脱碱基区域(abasicregion)。在本实施例中,当脱碱基区域位于所述纳米孔的β-桶状物(β-barrel)内时,流经通道的电流与聚合(dA)区域位于所述β-桶状物内时更多。从上部到下部的电流水平的转变指示适配体-分析物复合物的离解。图2示出了在存在(b)和不存在(a)凝血酶的情况下观察到的适配体序列5A15x10A_TBA的不同阻断水平(blocklevel)(对于(a)和(b),y轴=电流(pA),x轴=时间(s))。a)当在不存在凝血酶的情况下溶液中存在适配体(序列5A15x10A_TBA)时,观察到单独的水平1。b)当溶液中存在适配体(序列5A15x10A_TBA)和凝血酶时,检测到水平1和2(所述水平之间的差是30.5pA)。水平2的外观表明适配体结合至凝血酶,从水平2到水平1的转变表明适配体-凝血酶复合物发生离解。图3示出了凝血酶浓度和所观察到的事件率(仅将凝血酶结合事件的数目与凝血酶结合与未结合事件的数目之和相比)之间的关系。这两个图表明了凝血酶结合事件与事件(凝血酶结合与未结合事件)的总数之间的比率是如何随着凝血酶浓度而变化的。在本实验中使用的探针序列是5A15x10A_TBA,最终浓度为1250nM。使用这些校准曲线图,可以以确定样本中凝血酶的浓度(曲线图(a)中y轴=(结合/非结合的)比率,x轴=凝血酶浓度(nM),曲线图(b)中y轴=比率,x轴=log10凝血酶浓度(nM))。图4示出了在凝血酶存在(b)和不存在(a)的情况下观察到的适配体序列15X15A_TBA3’CholTEG(SEQIDNO:19,其3'端具有胆固醇TEG)的不同阻断水平(对于(a)和(b),y轴=电流(pA),x轴=时间(s))。a)当在不存在凝血酶的情况下溶液中存在适配体(序列15x15A_TBA_3’CholTEG)时,观察到单独的水平1。b)当在存在凝血酶的情况下预培养了适配体时,检测到水平1和2。水平2的外观表明适配体结合至凝血酶,并且从水平2到水平1的转变表明适配体-凝血酶复合物发生离解。该实验的实施所使用的适配体浓度比实施例2中所使用的低很多。图5示出了如何使用很多不同适配体来检测凝血酶的存在,其中每种适配体产生自己独特的阶梯水平信号。上图(a)示出了检测到的三个适配体信号的事件数目(标记为A部分)和不同适配体尾部结合于凝血酶时每个适配体的信号(标记为B部分)。将适配体15x15A结合到凝血酶的事件标记为1,适配体17x13A结合到凝血酶的事件标记为2,适配体19x11A结合到凝血酶的事件标记为3,适配体5A15x10A结合到凝血酶的事件标记为4。x轴上示出的比率为适配体尾部除以开放的孔水平(二进制大小(binsize)=0.0025)得到的电流水平,y轴是计数。下图(b,y轴=电流(pA),x轴=时间(s))显示了检测到的每个适配体尾部序列(1-4)的4个不同的阻断信号。未注意到每个适配体的单独的识别信号。图6示出了在存在(b)和不存在(a)PDGF的情况下观察到的适配体序列17x8A_PDGF的不同阻断水平(对于(a)和(b),y轴=电流(pA),x轴=时间(s))。a)当在不存在PDGF的情况下溶液中存在适配体(序列17x8A_PDGF)时,观察到单独的水平1。b)当溶液中存在适配体(序列17x8A_PDGF)和PDGF时,检测到水平1和2。水平2的外观表明适配体结合至PDGF,从水平2到水平1的转变表明适配体-P本文档来自技高网...
适配体方法

【技术保护点】
一种确定样本中两个或多个分析物的组中的一个或多个分析物成员是否存在的方法,该方法包括:(a)使所述样本与跨膜孔和两个或多个探针的组相接触,其中,每个探针识别所述分析物成员中的一个或多个并包括(i)适配体,其结合到所述分析物成员中的一个或多个,和(ii)尾部,其能够进入所述孔并根据探针中的所述适配体是否结合到所述分析物成员之一而对流经所述孔的电流具有不同影响,其中每个探针以独特的方式影响流经所述孔的电流,并且其中所述两个或多个分析物的组中的每个分析物成员被所述探针组中的至少一个探针认别;和(b)测量流经所述孔的电流,以确定——如果有的话——所述探针组中的哪些探针已经结合至分析物成员并由此确定所述样本中一个或多个分析物成员是否存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.02.15 US 61/599,2401.一种确定样本中两个或多个分析物的组中的一个或多个分析物成员是否存在的方法,该方法包括:(a)使所述样本与跨膜蛋白孔和两个或多个探针的组相接触,其中,所述组中的探针不偶联到所述跨膜蛋白孔,其中,每个探针识别所述分析物成员中的一个或多个并包括(i)适配体,其结合到所述分析物成员中的一个或多个,和(ii)尾部,其能够进入所述跨膜蛋白孔并根据探针中的所述适配体是否结合到所述分析物成员之一而对流经所述跨膜蛋白孔的电流具有不同影响,其中每个探针以独特的方式影响流经所述跨膜蛋白孔的电流,并且其中所述两个或多个分析物的组中的每个分析物成员被所述探针组中的至少一个探针认别;和(b)测量流经所述跨膜蛋白孔的电流,以确定——如果有的话——所述探针组中的哪些探针已经结合至分析物成员并由此确定所述样本中一个或多个分析物成员是否存在。2.根据权利要求1所述的方法,其中每个探针在其适配体未结合至所述分析物成员时以不同方式影响流经所述跨膜蛋白孔的电流。3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述探针组中的至少一个探针识别所述两个或多个分析物的组中的一类分析物成员并且含有与该类分析物成员结合的适配体。4.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述探针组中的至少一个探针特异性识别所述分析物成员之一并且含有特异性结合至所述分析物成员的适配体。5.根据权利要求1所述的方法,其中所述探针组中的每个探针特异性识别所述分析物成员之一并且含有特异性结合至所述分析物成员的适配体。6.根据权利要求1所述的方法,其中所述尾部包含至少两个区域,所述至少两个区域以不同方式影响流经所述跨膜蛋白孔的电流,一个区域在适配体未结合至所述分析物成员之一时位于所述跨膜蛋白孔中,另一个区域在适配体结合至所述分析物成员时位于所述跨膜蛋白孔中。7.根据权利要求1所述的方法,其中所述尾部包含聚合物。8.根据权利要求7所述的方法,其中所述聚合物为多核苷酸、多肽或聚乙二醇(PEG)。9.根据权利要求1所述的方法,其中所述尾部包含至少一个单链多核苷酸。10.根据权利要求9所述的方法,其中所述尾部包含具有不同核苷酸序列的单链多核苷酸的至少两个区域,所述至少两个区域以不同方式影响流经所述跨膜蛋白孔的电流,一个区域在适配体未结合至所述分析物成员之一时位于所述跨膜蛋白孔中,另一个区域在适配体结合至所述分析物成员时位于所述跨膜蛋白孔中。11.根据权利要求10所述的方法,其中所述至少两个区域对应于至少两段不同的核苷酸或不同的多核苷酸条形码。12.根据权利要求1所述的方法,其中所述尾部包含不同聚合物的至少两个区域,所述至少两个区域以不同方式影响流经所述跨膜蛋白孔的电流,一个区域在适配体未结合至所述分析物成员之一时位于所述跨膜蛋白孔中,另一个区域在适配体结合至所述分析物成员时位于所述跨膜蛋白孔中。13.根据权利要求8所述的方法,其中所述尾部包含至少一个双链多核苷酸。14.根据权利要求8-13中任一项所述的方法,其中所述尾部包含7至70个核苷酸长度的多核苷酸。15.根据权利要求1,2和5-13任一项所述的方法,其中所述尾部包含SEQIDNO:7至23的1-30个残基。16.根据权利要求1,2和5-13任一项所述的方法,其中所述探针组中的每个探针含有不同的适配体。17.根据权利要求1,2和5-13任一项所述的方法,其中所述探针组中的每个探针含有不同的单链多核苷酸尾部。18.根据权利要求1,2和5-13任一项所述的方法,其中所述探针组中的两个或多个探针含有不同的适配体和相同的单链多核苷酸尾部。19.根据权利要求1,2和5-13任一项所述的方法,其中所述探针组中探针的数目与所述两个或多个分析物的组中分析物成员的数目相同。20.根据权利要求1,2和5-13任一项所述的方法,其中所述探针组中的两个或多个探针含有相同的适配体和不同的单链多核苷酸尾部。21.根据权利要求1,2和5-13任一项所述的方法,其中所述探针组中的两个或多个探针含有不同的适配体,所述适配体特异性结合至相同的分析物成员。22.根据权利要求1,2和5-13任一项所述的方法,其中所述探针组中的每个探针偶联至膜。23.根据权利要求22所述的方法,其中每个探针使用胆固醇偶联至所述膜。24.根据权利要求1,2和5-13任一项所述的方法,...

【专利技术属性】
技术研发人员:丹尼尔·约翰·特纳丹尼尔·乔治·福德姆罗杰·查尔斯·吉尔克莱夫·加文·布朗斯图尔特·瑞德詹姆斯·安东尼·克拉克詹姆斯·怀特
申请(专利权)人:牛津纳米孔技术公司
类型:发明
国别省市:英国;GB

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