烟草热休克蛋白基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种烟草热休克蛋白基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。本发明专利技术利用烟草各个发育时期的44个组织样品，通过实时荧光定量PCR实验比较HSC70-1基因与烟草常用的8个内参基因的表达稳定性，发现其表达稳定性优于所有8个常用内参基因。可见，将HSC70-1基因应用于烟草实时荧光定量PCR实验中，能够提高相对定量结果的准确性，为烟草实时荧光定量PCR实验提供了一个新的工具。

【技术实现步骤摘要】
烟草热休克蛋白基因及其应用
本专利技术涉及烟草实时荧光定量PCR实验中内参基因的选择，特别是涉及烟草热休克蛋白基因HSC70-1作为新的内参基因在实时荧光定量PCR中的应用。
技术介绍
实时荧光定量PCR是基因表达研究的一种重要研究手段，具有定量准确、灵敏度高、重复性好等特点。为了消除模板质量/数量、PCR反应效率、实验材料差异等因素对定量结果的影响，实时荧光定量PCR通常使用内参基因进行校正和标准化，其结果的准确性很大程度上取决于内参基因的选择。烟草实时荧光定量PCR研究中通常使用持家基因作为内参基因，因为持家基因参与植物的基本生化代谢过程，是植物维持生命活动所必需的，其在所有的细胞和生理状态下都较稳定地表达。但已有研究结果表明，持家基因在不同组织器官和发育时期样品中的稳定性不同，其表达并不是恒定不变的。因此持家基因作为内参基因存在缺陷，需要寻找新的内参基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于寻找表达稳定性显著优于传统内参基因的基因，进而为烟草实时荧光定量PCR实验提供新的内参基因。本专利技术的技术方案是：一种烟草热休克蛋白基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。一种烟草热休克蛋白基因，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用。所述的烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用，所述烟草实时荧光定量PCR的特异性引物对为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4。本专利技术中烟草热休克蛋白基因是一个新发现的烟草实时荧光定量PCR内参基因，通过与烟草中常用的8个内参基因的表达稳定性比较，烟草热休克蛋白基因表达稳定性优于所有8个常用内参基因。鉴于该基因的应用价值及其利用潜力的应用前景，有必要通过专利加以保护。本专利技术提供的烟草新内参基因编码烟草热休克蛋白，来源于烟草(Nicotianatabacum)，命名HSC70-1。本专利技术的烟草热休克蛋白基因HSC70-1可以是cDNA序列，也可以是基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。本专利技术的有益效果是：利用烟草各个发育时期的44个组织样品(每个样品3个重复)，通过实时荧光定量PCR实验比较HSC70-1基因与烟草常用的8个内参基因的表达稳定性，发现其表达稳定性优于所有8个常用内参基因。可见，将HSC70-1基因应用于烟草实时荧光定量PCR实验中，能够提高相对定量结果的准确性，为烟草实时荧光定量PCR实验提供了一个新的工具。附图说明图1为烟草热休克蛋白基因的实时荧光定量PCR溶解曲线；图2为常用内参基因Actin的实时荧光定量PCR溶解曲线；图3为常用内参基因PP2A的实时荧光定量PCR溶解曲线；图4为常用内参基因L25的实时荧光定量PCR溶解曲线；图5为常用内参基因Ntubc2的实时荧光定量PCR溶解曲线；图6为常用内参基因EF-1α的实时荧光定量PCR溶解曲线；图7为常用内参基因α-Tubulin的实时荧光定量PCR溶解曲线；图8为常用内参基因β-Tubulin的实时荧光定量PCR溶解曲线；图9为常用内参基因18SrRNA的实时荧光定量PCR溶解曲线。具体实施方式一种烟草热休克蛋白基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。所述的烟草热休克蛋白基因，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用，针对所述烟草热休克蛋白基因设计PCR引物，在烟草中开展基于实时荧光定量PCR实验的定量表达分析。。所述的烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用，所述烟草实时荧光定量PCR的特异性引物对为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4。烟草中常用的内参基因为8个持家基因，包括Actin、PP2A、L25、Ntubc2、EF-1α、α-Tubulin、β-Tubulin和18SrRNA。基于芯片数据和实时荧光定量PCR实验，比较所述烟草热休克蛋白基因与烟草常用的8个内参基因的表达稳定性，发现其表达稳定性优于所有8个常用内参基因。将烟草热休克蛋白基因应用于烟草实时荧光定量PCR实验中，能够提高定量结果的准确性。1、基于芯片数据的表达稳定性分析使用EBIArrayExpress数据库中的100张Affymetrix芯片数据(数据编号：E-MTAB-176)，比较烟草热休克蛋白基因(HSC70-1)与8个常用烟草内参基因的表达稳定性，结果见表1，其中变异系数越小表明该基因表达稳定性越高。表1结果表明，烟草热休克蛋白基因表达稳定性优于所有8个常用烟草内参基因。表1烟草热休克蛋白基因和常用内参基因芯片数据分析结果2、基于实时荧光定量PCR实验的表达稳定性分析2.1引物设计根据烟草热休克蛋白基因的序列设计PCR引物，所得引物通过BLAST比对确保引物特异性良好。通过对设计的引物进行筛选，确定实验用引物。8个常用内参基因的引物使用文献中已经报道的引物。具体信息见表2。表2引物序列信息表2.2烟草样品与RNA提取烟草组织样品取自红花大金元完整生长周期内，覆盖种期(胚根“露白”)、猫耳期、团棵期、旺长期、现蕾期、盛花期、下部叶成熟期和中部叶成熟期，包括种子、根、茎、叶、须根、花蕾、花萼、花冠、花药、花丝、柱头、花柱、子房、雄蕊和果皮等组织器官，共计44个样品，每个样品3个重复。总RNA提取使用Tripure试剂。2.3实时荧光定量PCR实验总RNA反转录为cDNA(采用Takara公司反转录试剂盒)后，使用Bio-RadCFX96仪器进行qRT-PCR实验。20μL反应体系：1μLcDNA；10μLQIAGENSYBRGreen；5μLRNasefreeH2O；上下游引物各2μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火30s，循环40次；溶解曲线绘制。烟草热休克蛋白基因和8个常用内参基因的实时荧光定量PCR溶解曲线(图1-9)表明，其引物扩增特异性良好。2.4数据分析使用Bio-RADCFXManager软件分析PCR实验结果，获得每个基因的CT值，绘制溶解曲线。CT值导入qbase+软件，qbase+软件通过计算geNormM(GeneStabilityMeasure)比较内参基因在不同样品中的表达稳定性，geNormM值越低，基因表达稳定越好。表3实时荧光定量PCR实验表达稳定性分析结果基因geNormVHSC70-10.478L250.493EF-1α0.523Ntubc20.671β-Tubulin0.81818SrRNA0.915α-Tubulin1.010Actin1.113PP2A1.251geNorm分析结果表明(表3)，烟草热休克蛋白基因表达稳定性优于所有8个常用烟草内参基因，将其应用于烟草实时荧光定量PCR实验中，能够提高定量结果的准确性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草热休克蛋白基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种表达稳定的烟草热休克蛋白基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。2.如权利要求1所述的表达稳定的烟草热休克蛋白基因，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.如权利要求1所述的表...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹培健，王燃，许亚龙，李泽锋，卢鹏，杨军，李锋，魏春阳，罗朝鹏，金立锋，林福呈，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41