本发明专利技术涉及一种伏马毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途。该免疫亲和纯化柱利用蛋白G偶联到琼脂糖凝胶载体上，然后用抗伏马毒素的抗体与琼脂糖上的蛋白G偶联。偶联后的伏马毒素抗体-蛋白G-琼脂糖凝胶载体复合载体装填亲和柱。该免疫亲和柱主要用于对于食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的伏马毒素的纯化，以便于后期对样本中伏马毒素的高效液相色谱(HPLC)检测和荧光检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及。该免疫亲和纯化柱利用蛋白G偶联到琼脂糖凝胶载体上，然后用抗伏马毒素的抗体与琼脂糖上的蛋白G偶联。偶联后的伏马毒素抗体-蛋白G-琼脂糖凝胶载体复合载体装填亲和柱。该免疫亲和柱主要用于对于食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的伏马毒素的纯化，以便于后期对样本中伏马毒素的高效液相色谱(HPLC)检测和荧光检测。【专利说明】
: 本专利技术涉及一种伏马毒素的免疫亲和柱及其制备方法和用途。属食品安全检测领域。
技术介绍
: 伏马毒素(Fumon isins)是一组主要由串珠键刀菌(Fusarium moniIiforme)在一定温度和湿度条件下繁殖所产生的真菌毒素。伏马毒素在自然界中分布广泛，且危害性大，逐渐引起了国内外学者的高度重视。目前，已发现的伏马毒素结构类似物主要分为A、 B、C、P四类。研究证实伏马毒素可致马大脑白质软化症(EL-EM)，神经性中毒而表现意识障碍、失明和运动失调等症状，严重者甚至造成死亡。对猪造成肺水肿综合征(PPE)，并能造成肝脏和食道损伤。伏马毒素还可引起灵长类动物的动脉粥样硬化样改变，诱发大鼠肝癌。与人类食道癌的发生也密切相关。国际癌症研究机构与加利福尼亚环境保护机构已宣布伏马毒素为人类潜在的致癌物质(2B级致癌物)。伏马毒素污染的主要是玉米及其制品，此外还有一些如大米、高粱、小米、牛奶、啤酒等食品。目前世界各地关于伏马毒素污染的报导较多，其中玉米及其制品的污染占了大部分。高含量的伏马毒素在很多国家和地区的玉米及玉米制品中都有报道，如韩国、中国、巴西、尼日利亚、南非、英国、法国和意大利。中国四川、浙江、河南等省份也有伏马毒素污染情况的调查，阳性检出率都较高。有调查在2005年从河南、湖北、广东、四川、广西、吉林等6个省市收集了 282份玉米样品进行检测。99.6%的样品表现伏马毒素阳性，平均污染含量为6662ng/g。 基于伏马毒素的污染范围较广,毒性作用也较基于伏马毒素的污染范围较广,毒性作用也较大，许多国家和地区对伏马毒素进行了系统研究。但目前国际上对于食品与饲料中伏马毒素的限量及检测方法尚无统一标准。瑞典规定人类食物中伏马毒素的限量为lmg/kg，美国食品与药品管理局(FDA)发布了供人类食用的玉米和玉米产品伏马毒素的最高限量指导性公告，规定人类食用玉米中伏马毒素最高限量为2mg/kg。同时，FDA的畜牧医学中心(CVM)也发布了动物饲料中伏马毒素的最高限量指导性公告，规定其限量范围为I?50mg/kg。在FA0/WH0联合会上关于食品添加剂的会议(2001年2月)中规定，伏马毒素对人体的安全限量为每天摄入量按人体体重算FB1、FB2、FB3量不超过2ug/kg。我国对此的相关法规也正在制定中。在出入境检验检疫行业推荐标准中，液相色谱法对伏马毒素BUB2的测定低限均为0.05mg/kg。 目前伏马毒素的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联免疫分析法等。 其中薄层层析法是最早使用也是最广泛使用的检测伏马毒素的方法，其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低，无需价格昂贵的仪器，。但是薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量，主观影响较大，灵敏度不高等，已远远不能满足现代检测要求。 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法检测特异、快速、灵敏度高、并且成本较低。成本低的特点，适用于基层机构大量样品的筛选和普查，可以大大节省时间和费用，因此越来越受到基层检验单位的欢迎。ELISA方法的主要问题是容易造成假阳性。因此主要用于基层的筛查检测。 高效液相色谱法(HPLC)具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点，是目前常用于食品中毒素检测的方法。但因其对样品中毒素纯度的要求较高，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样品快速筛选的需要，所以使用受到限制。今年来发展起来的免疫亲和柱-高效液相色谱(IAC-HPLC))将免疫亲和纯化技术与高效液相色谱相结合。使HPLC的使用更加广泛。免疫亲和柱作为一种新的净化技术，在真菌毒素的分析检测中应用越来越广泛。它是将特异性抗体结合到活化的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时，其中的抗原与抗体结合，其他杂质则通过水溶液洗掉，再用有机溶剂将抗原即毒素洗脱下来，从而使样品中的毒素得以净化。 目前制备免疫亲和纯化柱的方法大概有:溴化氰活化直接偶联法、环氧氯丙烷法、过碘酸钠法等。这些方法的基本原理都是将载体基质进行化学活化后，将抗体偶联到载体上。但是由于偶联是非特异性的，抗体的任何部位都有可能和载体偶联，方向性是不可控制的。势必影响亲和纯化柱纯化伏马毒素的效率。
技术实现思路
: 本专利技术的目的在于提供 为了达到上述目的，在本专利技术中，利用了蛋白G的功能，蛋白G是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fe部位相结合。并且具有很高的亲和力。我们克隆了蛋白G的基因序列，并且对其密码子进行了优化、重组后，在大肠杆菌中表达出了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G。将基因重组的蛋白G偶联到载体上后，再将伏马毒素抗体偶联到蛋白G上，制备出了伏马毒素-蛋白G-载体，再用交联剂将载体进行交联。交联后的载体装柱后就形成了高亲和力的伏马毒素免疫亲和柱。该亲和柱操作简便，纯化伏马毒素效率高。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的伏马毒素。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。 具体操作如下: 本专利技术最大的优势就是利用了蛋白G与Ig抗体特异性结合的特点，IgG抗体由两条重链和两条轻链构成，抗体分为Fab区和Fe区，其中，Fab区是抗原结合的区域。 蛋白G是链球菌细胞壁上的一种特殊的蛋白，与抗体的Fe区域有特异性的结合能力。蛋白G与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。经过我们基因优化重组后的蛋白G，I个分子的蛋白G可以结合3个分子的IgG抗体，具有很高的抗体亲和力。并且只有抗体能与蛋白G结合，其余蛋白均不能与蛋白G结合，特异性很高。以此蛋白G为基础制备的免疫亲和柱具有特异性好，伏马毒素结合量大，纯化效率高的特点。 伏马毒素免疫亲和柱及其制备方法说明如下: 1.载体活化 选择琼脂糖载体，sepharose4B,以环氧氯丙烷活化法进行活化。 取2 %的预溶胀的琼脂糖凝胶sepharose4B,用20倍体积的蒸懼水充分冲洗,洗去残存的乙醇，用漏斗过滤掉水分。 称取滤去水份后的湿凝胶5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30%的环氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氧化钠NaBH4，5毫升，在25°C下摇床反应8小时。 反应后，用大量的蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。 2.将蛋白G与活化载体sepharose4B的偶联 将活化好的琼脂糖凝胶s印harose4B用偶联缓冲液(0.1M的NaHCO3,0.8M NaCl，PH8.9)洗涤3次。加入2mg/ml的蛋白G，室温偶联4小时。 将偶联好的琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次。偶联有蛋白G的琼脂糖载体sepharose命名为蛋白G-seph本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种伏马毒素的免疫亲和柱，其特征在于包含有载体、蛋白G和伏马毒素抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：柳家鹏，张彦明，孟丽敏，徐家兰，
申请(专利权)人：北京华安麦科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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