一种HIV-1多表位重组蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种HIV-1多表位重组蛋白及其编码基因与应用。本发明专利技术所提供的蛋白是如下a)或b)或c)：a)由序列1的第13-164位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)将a)或b)限定的蛋白经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，得到的且与抗HIV-1相关的蛋白质。实验证明，本发明专利技术所提供的HIV-1多表位重组蛋白具有很好的免疫原性，是一种具有应用前景的用于HIV-1预防和治疗的免疫活性蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种HIV-1多表位重组蛋白及其编码基因与应用
本专利技术属于生物
，涉及一种HIV-1多表位重组蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)感染所致的获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)。自1981年世界报道首例艾滋病(AIDS)病例以来，短短30余年，艾滋病迅速在全球范围内蔓延扩散，成为当今全球最大的健康危机，也是影响我国公众健康的重要公共卫生问题。近年来，艾滋病感染在我国出现新的流行态势，即发病率逐年增加，感染对象覆盖不同人群，性传播比例增多，尤其是男-男同性恋病人上升显著，变异重组病毒在流行分离株中所占比例增多。如何有效防治HIV感染，降低发病率和病死率是我国面临的紧迫任务。疫苗是控制HIV感染的有效手段，虽然在HIV疫苗研发方面取得了重要的进展，一种能够同时诱导体液和细胞免疫的HIV疫苗RV144的临床III期试验表明，该疫苗能够在一定程度上降低HIV的感染从而降低艾滋病的发生，但仍然没有有效的疫苗应用于人群。应用HIV-1疫苗预防和治疗HIV-1感染仍然是HIV研究的重要课题。一种有效的HIV疫苗应该能诱导针对不同流行株、适用于不同人群，由于我国流行的HIV病毒与其它国家和地区不同，人群MHC限制性不同，在疫苗设计时应该选择针对不同流行株和中国主要HLA亚型的HIV保护性表位，以期诱导有效的体液和细胞免疫应答。重组蛋白疫苗与核酸疫苗及活病毒载体疫苗相比具有更好的安全性，更加适于将来临床应用。专利技术内容本专利技术的目的是提供一种HIV-1多表位重组蛋白及其编码基因与应用。本专利技术所提供的HIV-1多表位重组蛋白，包含在中国主要HIV-1流行株中高度保守、且为中国主要HLA亚型MHC限制性的12个HIV-1T细胞表位，将该蛋白命名为HIV-MEP1，具体可为如下(a)或(b)或(c)所述的蛋白质：(a)由序列表中序列1的第13-164位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列表中序列1的第13-164位所示的氨基酸序列，或序列表中序列1所示的氨基酸序列，经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，得到的且与抗HIV-1相关的由(a)或(b)衍生的蛋白质。其中，序列1由164个氨基酸组成，第5-10位为6个His标签，第13-164位为HIV-1多表位蛋白。所述HIV-MEP1蛋白在制备HIV-1疫苗中的应用也属于本专利技术的保护范围。活性成分为所述HIV-MEP1蛋白的HIV-1疫苗也属于本专利技术的保护范围。根据需要，所述HIV-1疫苗中还含有佐剂，具体如铝佐剂。所述铝佐剂即可为氢氧化铝佐剂，也可为磷酸铝佐剂。在本专利技术中，采用的所述铝佐剂具体为2％氢氧化铝(InvivoGen公司，其产品目录号为Vac-alu-250)。在所述HIV-1疫苗中，所述HIV-MEP1蛋白与所述铝佐剂的质量配比可为25：1。编码所述HIV-MEP1蛋白的核酸分子也属于本专利技术的保护范围。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。在本专利技术的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述HIV-MEP1蛋白的基因(名称为HIV-MEG1.E)，所述HIV-MEG1.E基因为如下1)-4)中任一所述的DNA分子：1)序列表中序列2的第37-495位所示的DNA分子；2)序列表中序列2的第1-495位所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述HIV-MEP1蛋白的DNA分子；4)与1)或2)所限定的DNA分子至少具有90％以上同源性且编码所述HIV-MEP1蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。其中，序列2由499个核苷酸组成，第13-30位编码序列1的第5-10位所示的6个His标签蛋白，第37-495位编码序列1的第13-164位所示的HIV-1多表位蛋白。序列2的第1-495位编码序列1所示的蛋白质。含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。在本专利技术中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为T5启动子。更加具体的，所述重组表达载体为将序列表中序列2的第37-493位所示的DNA片段插入到pQE30载体的多克隆位点处得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为BamHI和HindIII。所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下任一中的应用也属于本专利技术的保护范围：(1)制备抗HIV-1病毒的药物；(2)治疗和/或预防艾滋病的药物。所述蛋白质的制备方法也属于本专利技术的保护范围。所述蛋白质的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述核酸分子导入目的大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，培养重组大肠杆菌，得到所述蛋白质。在所述方法中，所述目的大肠杆菌可为大肠杆菌M15。在所述方法中，所述培养重组大肠杆菌的过程中，向培养体系中加入IPTG至终浓度为1mM，诱导培养4小时。本专利技术所提供的HIV-1多表位重组蛋白(HIV-MEP1蛋白)与DNA疫苗相比，具有更好的安全性，同时具有较强的免疫原性，有望用于HIV的预防和治疗。BALB/c小鼠体内免疫学研究表明，HIV-MEP1蛋白单独免疫小鼠即可诱导机体产生较高水平的体液和细胞免疫应答，铝佐剂可以同时增强其诱导的体液和细胞免疫应答；人HLAA2.1/DR1转基因小鼠体内免疫学研究表明，HIV-MEP1可诱导人MHC限制性的特异性细胞免疫应答。说明HIV-1多表位重组蛋白(HIV-MEP1蛋白)具有很好的免疫原性，是一种具有应用前景的用于HIV-1预防和治疗的免疫活性蛋白。附图说明图1为重组表达载体pQE30-HIV-MEP1.E.coli的BamHI和HindIII酶切鉴定结果。其中，M为DNA分子量标准；1为重组表达载体pQE30-HIV-MEP1.E.coli经BamHI和HindIII酶切的结果。图2为HIV-1多表位重组蛋白HIV-MEP1的表达、纯化与鉴定。其中，A为HIV-MEP1蛋白纯化过程产物分析，M：蛋白分子量标准，1：8M脲溶解包涵体溶液，2：穿柱液，3：平衡缓冲液洗脱液，4：20mM咪唑洗脱液，5：50mM咪唑洗脱液，6：300mM咪唑洗脱液。B为纯化复性后的HIV-MEP1蛋白的SDS-PAGE分析结果。C为Westernblot鉴定结果。图3为HIV-1重组蛋白HIV-MEP1在BALB/c小鼠体内诱导的体液免疫和细胞免疫。其中，A为重组蛋白HIV-MEP1诱导的抗体水平及亚类分析；B为以12个HIV-1混合肽刺激小鼠脾细胞ELISPOT检测结果。图中，Al+HIV-MEP1即为添加了铝佐剂的组1；**表示p<0.01；***表示p<0.001。图4为HIV-1重组蛋白HIV-MEP1免疫的BALB/c小鼠不同肽激活脾细胞I本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白质，是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列1的第13‑164位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列表中序列1的第13‑164位所示的氨基酸序列，或序列表中序列1所示的氨基酸序列，经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，得到的且与抗HIV‑1相关的由(a)或(b)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.HIV-1疫苗，其活性成分为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1的第13-164位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序...

【专利技术属性】
技术研发人员：周育森，寇志华，杨裔，郭彦，于虹，孙世惠，赵光宇，李军锋，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11