一种多用途聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体及其制备方法与应用技术

一种多用途聚赖氨酸荧光自组装载药纳米微球及其制备方法与应用。本发明专利技术采用纳米自组装技术制备了罗丹明标记的聚赖氨酸荧光纳米微球，并修饰了带有二硫键的叠氮基团侧链，进一步采用点击化学方法将炔基修饰的药物连接在荧光纳米微球上。本发明专利技术所制备的链接药物的聚赖氨酸纳米自组装微球可用于被修饰药物在动物以及细胞水平的示踪成像分析。同时利用该微球还可以用于捕获被修饰药物的结合蛋白，并通过裂解二硫键可释放出靶点结合蛋白及其关联蛋白，可用于药物作用靶点的研究。本发明专利技术提供了一种研究药物作用靶点的简便快捷的工具和方法，该方法集合药物示踪、靶点定位、靶点蛋白捕获及分离功能于一体，简便易行，在药物作用机制研究以及靶点发现方面有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种多用途聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体及其制备方法与应用
本专利技术属于生物医药
，涉及一种连接有荧光示踪基团的聚赖氨酸纳米自组装微球载体的制备工艺，并进一步采用点击化学技术共价偶联被修饰药物的方法。以及利用本专利技术所制备的载药微球，对被修饰药物进行的整体动物和细胞水平的示踪成像分析，药物靶点定位，靶点蛋白捕获分离方面的应用。
技术介绍
ε-聚赖氨酸（Poly-L-lysine，PL)是由25～30个赖氨酸残基通过酰胺键依次连接而成的同型单体直链状聚合物。聚赖氨酸为白色或淡黄色粉末，吸湿性强，略有苦味，不受pH值影响。ε-聚赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，其具有抑菌谱广、水溶性大、热稳定性好、可生物降解且对人和环境无毒害等优点，已经成为优良的食品防腐保鲜剂。ε-聚赖氨酸能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体必需的氨基酸，也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸。因此ε-聚赖氨酸是一种营养型抑菌剂，安全性高于其他化学防腐剂，其急性口服毒性为5g/kg。ε-聚赖氨酸的抑菌谱广，对于酵母属中的尖锐假丝酵母、法红酵母、产膜毕氏酵母、玫瑰掷孢酵母；革兰氏阳性菌中的耐热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌；以及革兰氏阴性菌中的产气节杆菌、大肠杆菌等引起食物中毒与腐败的菌有强烈的抑制作用。分子量在3600～4300之间的ε-聚赖氨酸其抑菌活性最好，当分子量低于1300时，ε-聚赖氨酸则失去抑菌活性。此外，由于ε-聚赖氨酸带正电，能与带负电的物质发生强烈的静电吸引力，易通过生物膜且不易分解，可以有效降低药物阻力提高药物的转运效率。聚赖氨酸还具有能促进细胞生长和粘附以及促进细胞发挥正常功能等作用，因此作为药物的缓释和靶向载体ε-聚赖氨酸已被广泛用于生物医药领域。作为生物高分子材料骨架，中国专利（申请号：2014100723354）公开了一种可溶解凝血酶纳米颗粒的制备方法，该纳米颗粒以凝血酶为核心，外壳是由水溶性直链淀粉与聚赖氨酸交联形成的纳米粒子；中国专利（申请号：2013107289643，2013106763740）分别公开了ε-聚赖氨酸水凝胶的制备方法，以及由该专利技术衍生的伤口组织愈合材料；中国专利（申请号：2012101329801）提供了一种两亲性三嵌段共聚物的纳米载体制剂，该共聚物由包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物组成，在水溶液中可以自组装形成具有三层结构的纳米载体，并能有效负载小分子疏水性药物、基因以及蛋白质或多肽。作为药物载体，中国专利（申请号：2013106705336）提供了一种作为疏水性药物的载体的双敏感响应型聚合物纳米胶束，其成分为正丁胺-聚赖氨酸(叶酸/2，3-二甲基马来酸)-b-聚半胱氨酸；中国专利（申请号：2004100680618）公开了一种短肽修饰的聚赖氨酸与聚乳酸共聚物纳米粒，该纳米粒包括药物和由精氨酰－甘氨酰－天冬氨酰序列短肽、修饰的聚赖氨酸－聚乳酸共聚物纳米粒载体组成，可用于有机药物、水溶性药物或水不溶性抗癌药物；中国专利（申请号：2004100466794）提供了一种应用“成胶现象”合成半乳糖化海藻酸钠与多聚赖氨酸纳米胶的制备方法，所得到的肝靶向性纳米基因载体系统能为原发性肝癌的靶向基因治疗提供材料；此外，中国专利（申请号：2013101802363）还公开了一种双敏感可崩解式纳米囊泡药物载体，其中双敏感两亲性嵌段共聚物由还原敏感的二硫键及pH敏感的碳氮双键桥连亲水性聚乙二醇和疏水性苄氧羰基保护的聚赖氨酸而成。该载体制剂具有疏水双分子膜及亲水内腔，疏水双分子膜负载疏水药物，亲水内腔负载亲水药物，可有效利用肿瘤细胞中的还原环境及酸性环境使得载体制剂崩解释放药物实现靶向释药。作为荧光成像纳米材料的骨架，中国专利（申请号：2012102228846）公开了一种功能性近红外荧光纳米微粒的制备方法。该纳米微粒平均粒径在15nm左右，以所装载的近红外荧光染料作为发光中心，以壳聚糖、聚赖氨酸为基本骨架，经海藻酸钠自组装包裹成壳制备而成；中国专利（申请号：201310470907X）还提供了一种信号放大型免疫荧光探针的制备方法。该探针的制备方法包括：在缩合剂的存在下，对苯二胺和均苯三甲酸经缩合反应得到多羧基大分子，多羧基大分子经活化后，依次加入抗体、聚赖氨酸进行反应，再用荧光标记物标记制得所述的探针。该探针标记有较多荧光标记物，结构稳定，可用于荧光免疫检测，具有检测灵敏度高、检测时间短、成本低等特点。此外，中国专利（申请号：2013101802363）还公开了一种两亲性三嵌段聚多肽ICG胶束，该胶束包括了分散有吲哚菁绿并由聚亮氨酸形成的内核，以及环绕内核由聚赖氨酸形成的中间层及部分穿插于所述中间层的由聚乙二醇形成的外壳。该胶束具备良好的空间稳定性以及出色的荧光性能、光热转换能力，可以实现对肿瘤细胞或组织进行光学成像和光热治疗。综上所述，目前国内外均以聚赖氨酸或共混其他高分子材料为骨架进行相关材料的开发。但尚未见以聚赖氨酸自身为骨架，一方面通过酰胺键共价连接荧光分子（罗丹明），并通过自组装技术制备纳米颗粒，另一方面采用点击化学技术共价结合可释放药物分子；同时可进行被修饰药物的体内外示踪成像分析，靶点定位以及靶点蛋白捕获分离，集合上述功能用途为一体的聚赖氨酸纳米材料的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用纳米自组装技术，通过引入荧光基团和可被裂解释药的二硫键基团制备聚赖氨酸载药纳米微球，并利用聚赖氨酸的生物相容性实现被修饰药物在动物组织和细胞内的示踪，以及靶点蛋白及其相关蛋白的捕获分离，提供一种多用途聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体的制备方法与应用。本专利技术可解决现有技术难以实现的药物示踪和靶点捕获一体化的问题。并以含有羟基或羧基的药物为例，通过丙炔酸酯化或丙炔胺的酰胺化修饰引入炔基，并通过和微球上修饰的叠氮基团的点击化学反应将药物连接到微球载体上，运用同一纳米载药微球，分别实现了药物体内代谢示踪、细胞内定位、以及靶点蛋白捕获分离等不同应用。本专利技术提供了一种多用途聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体，该载体是在骨架材料上共价连接有荧光标记基团和药物分子制成；所述的骨架材料是由含有25～30个赖氨酸残基通过酰胺键依次连接而成的同型单体聚合物；所述骨架材料上的赖氨酸残基同时修饰了带有二硫键的叠氮基团侧链以及荧光标记物，能够通过自组装制备纳米微球，并能用于药物分子的连接。所述的荧光标记基团是含有罗丹明的标记分子。具体是通过市售的罗丹明活化酯（NHS-罗丹明），与聚赖氨酸的氨基以酰胺键的形式和纳米微球载体相连接。所述的带有二硫键的叠氮基团侧链，具体是通过市售的叠氮化试剂（Sulfo-SADP），其一端是活化酯，通过聚赖氨酸的氨基以酰胺键的形式与纳米微球载体相连接。所述的药物分子，是炔基修饰的药物衍生物，通过丙炔酸与含有羟基的药物进行酯化反应引入炔基，或通过丙炔胺与含有羧酸的药物进行酰胺化反应引入炔基，并进一步通过点击化学的方法将其炔基修饰的药物衍生物与含有叠氮侧链纳米微球载体相连接。具体制备方法如下：第1、向含有1%至5%Span-80的由汽油和四氯化碳组成的混合有机相（汽油和四氯化碳的体积比可为1:3至3:1）中加入NHS-罗丹明溶解，并再加入溶解有0.2%-2%的聚赖氨酸的水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多用途聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体，是在骨架材料上共价连接有荧光标记基团和药物分子制成；所述的骨架材料是由含有25～30个赖氨酸残基通过酰胺键依次连接而成的同型单体聚合物；所述骨架材料上的赖氨酸残基同时修饰了带有二硫键的叠氮基团侧链以及荧光标记物，能够通过自组装制备纳米微球，并能用于药物分子的连接。

【技术特征摘要】
1.一种多用途聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体，是在骨架材料上共价连接有荧光标记基团和药物分子制成；所述的骨架材料是由含有25～30个赖氨酸残基通过酰胺键依次连接而成的同型单体聚合物；所述骨架材料上的赖氨酸残基同时修饰了带有二硫键的叠氮基团侧链以及荧光标记物，能够通过自组装制备纳米微球，并能用于药物分子的连接。2.根据权利要求1所述的聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体，其特征在于所述的荧光示踪标记基团是含有罗丹明的标记分子。3.根据权利要求2所述的聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体，其特征在于所述的含有罗丹明的荧光标记分子是通过罗丹明的活化酯，与聚赖氨酸的氨基以酰胺键的形式进行连接。4.根据权利要求1所述的聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体，其特征在于所述的带有二硫键的叠氮基团侧链，其一端是活化酯，通过聚赖氨酸的氨基以酰胺键的形式与纳米微球载体相连接。5.根据权利要求1所述的聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体，其特征在于所述的药物分子，是炔基修饰的药物衍生物，并能够通过点击化学的方法将其与纳米微球载体的叠氮基团侧链相连接。6.权利要求1所述聚赖氨酸荧光自组装纳米微球载体的制备方法，其特征是该方法的具体制备如下：第1、向含有1％至5％Span-80的由汽油和四氯化碳组成的混合有机相中加入NHS-罗丹明，其中汽油和四氯化碳的体积比为1:3至3:1，溶解后再加入含有质量比为0.2％-2％聚赖氨酸的水溶液，10,000...

【专利技术属性】
技术研发人员：白钢，崔庆新，侯媛媛，姜民，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12