本发明专利技术公开了一种无标记电化学发光免疫传感器的制备方法及在肿瘤标志物的检测中的应用，属于新型纳米功能材料和生物传感器领域。本发明专利技术利用新型微纳米材料NH4CoPO4作为基底，使得鲁米诺–过氧化氢发光体系的发光稳定性大大增强，同时利用棒状的金@银核壳纳米粒子作为生物模拟酶催化发光体系，从而制备了一种成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速、制备简单的检测肿瘤标志物的无标记电化学发光免疫传感器。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种无标记电化学发光免疫传感器的制备方法及在肿瘤标志物的检测中的应用，属于新型纳米功能材料和生物传感器领域。本专利技术利用新型微纳米材料NH4CoPO4作为基底，使得鲁米诺–过氧化氢发光体系的发光稳定性大大增强，同时利用棒状的金@银核壳纳米粒子作为生物模拟酶催化发光体系，从而制备了一种成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速、制备简单的检测肿瘤标志物的无标记电化学发光免疫传感器。【专利说明】无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用
本专利技术涉及一种无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用。具体是 采用无标记的电化学发光方法，基于磷酸钴铵片状材料（nh4c〇po4)和金@银核壳纳米棒-鲁米诺-壳聚糖复合材料(Au@AgNRs-Lum-Chi)构建的快速、灵敏检测肿瘤标志物的免 疫传感器，属于新型纳米功能材料与生物传感器
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技术介绍
肿瘤的早期诊断、早期治疗是提高癌症患者生存率的关键。肿瘤标志物的检测可 反映肿瘤的生物学特性，对治疗、辅助诊断、判断预后均有重要意义。目前已有的肿瘤标志 物的临床检测方法很多，如酶免疫法、放射免疫法等，但这些检测方法存在诸多不足，如酶 免疫法中酶容易失活、放射免疫法中放射性污染严重等。因此，专利技术一种灵敏度高、特异性 强、工作条件要求不高的环境友好型肿瘤标志物传感器迫在眉睫。 电化学发光免疫传感器由于其灵敏度高、特异性好、操作简便等优点被广泛应用 于临床诊断、药物分析等领域，如肿瘤标志物传感器等。制备性能优越的电化学发光免疫 传感器，其最关键技术就是发光强度及稳定性和免疫分子的有效固定及重现性等性能的提 商。 鲁米诺-过氧化氢（Lum-H202)发光体系由于成本低廉、发光强度高，已被广泛应 用到电致化学发光的分析方法中，但由于Lum-H 202发光体系的发光需要借助一定的催化 齐?，才能有快速、灵敏、高强度的光信号响应，因此一般常加入辣根过氧化物酶（HRP)来进行 催化反应。而HRP的使用对反应条件要求苛刻，不利于Lum-H 202发光体系的普及使用。棒 状的金@银核壳纳米棒（AuOAgNRs)由于具有催化Lum-H 202发光体系的作用，因此可以作为 模拟酶被用来代替HRP，同时由于其为无机纳米材料，相比于HRP具有较宽泛的使用条件。 另外，AuOAgNRs具有比表面积大、易于与多种生物分子(核酸、蛋白质和生物分子等）结合、 对人体无害等特点，可被应用于电致化学发光免疫传感器的制备中。 NH4C〇P04是一种片状的微纳米材料，已被应用于超级传感器的研究中，由于其片状 结构，具有很好的充放电特性，应用到本专利技术中，可以达到稳定Lum-H202发光体系，并增大 电极比表面积的作用。 本专利技术先后使用NH4C〇P04和Au@AgNR S-Lum-Chi对电极进行修饰，然后利用肿瘤 标志物抗体以及与其特异性结合的抗原的相继加入，使得发光强度降低，从而实现了采用 无标记的电化学发光方法检测肿瘤标志物的免疫传感器的构建。本专利技术利用册1 4(：〇?04对 Lum-H202发光体系的稳定作用和AuOAgNRs对lum-H20 2发光体系的催化作用，设计了一种简 单、快速、特异性好和灵敏度高的无标记的电化学发光免疫传感器，并应用于肿瘤标志物的 检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于避免现有检测方法中存在的仪器设备复杂、操作过程繁琐 及对检验人员的技能要求高等缺点，提供一种无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的 制备方法，所制备的传感器具有灵敏度高、特异性强的特点，且制备简单、操作方便，可用于 肿瘤标志物的快速、灵敏检测； 本专利技术的目的之二在于将所制备的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器使用新 型功能材料作为模拟酶，替代了生物酶，避免了实际样品检测时生物酶失活及检测环境的 影响。 本专利技术采用的技术方案如下： 1.本专利技术所述的一种无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征 在于，制备步骤为： (1)金@银核壳纳米棒-鲁米诺-壳聚糖复合材料(Au@AgNRs-Lum-Chi)的制备 将20mL金纳米棒溶胶（AuNRs)和20mL 0·05?0·2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)溶液混合，在3(T45°C下搅拌，并顺序加入3飞mL 0. 1 mol/L的L-抗坏血酸（AA)溶 液、0.5?1 mL 0.05 mol/L的硝酸银（AgN03)溶液和3?6 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠 （NaOH) 溶液，停止搅拌，静置l~3h，离心分离，将产品重新分散到20mL水中，得到金@银核壳纳米 棒溶胶（AuOAgNRs)。 将：Γ5 mL 的 AuOAgNRs 和：Γ5 mL 1 X 1(Γ3 mol/L 的鲁米诺（Lum)溶液混合，搅拌 l~3h，离心分离，将产品重新分散到5mL质量分数为0.3?0.7 %的壳聚糖（CHi)溶液中， 得到 Au@AgNRs-Lum-Chi 溶液。 所述的AuNRs是2(T40nm长的棒状金纳米粒子的水溶液。 所述的Chi溶液是将Chi纯品加入到体积分数为1%的醋酸中制备而成。 (2)磷酸钴铵片状材料（NH4C〇P04)的制备 在40mL水中加入2. (Γ4.0 g铵盐和0.15?0.25 g磷酸盐，完全溶解后，加入0.15?0.25 g氯化钴，在30?45°C下搅拌l(Tl4h，离心分离，将产品置于50°C下干燥，即得到NH4C〇P04。 所述的铵盐选自下列之一：氯化铵、溴化铵、磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵。 所述的磷酸盐选自下列之一：磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵。 (3)无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法 1) 对工作电极进行预处理：将直径4 mm的玻碳电极依次用1. 0、3. 0和0. 05 Mm的三 氧化二铝抛光粉抛光处理，依次用乙醇和超纯水进行超声清洗； 2) 在1)中得到的电极表面滴加5~10 μ? 1~5 mg/mL的NH4C〇P04水溶液，室温下自然 瞭干； 3) 在2)中得到的电极表面滴加5~10 μ?的Au@AgNRS-Lum-Chi溶液，4 °C冰箱中保存 晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 °C保存； 4) 在3)中得到的电极表面滴加5~8 μ? 10 Pg/mL的肿瘤标志物抗体溶液，4 °C冰箱 中保存晚干； 5) 在4)中得到的电极表面滴加4飞μ? 100 Pg/mL的牛血清白蛋白（BSA)溶液，4 °C 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 °C保存，制得无标记电化学发光肿瘤标志物免 疫传感器。 2.本专利技术所述的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器，用于肿瘤标志物的 检测，步骤如下： 1) 将已知浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液加入到4(Γ60 μ?、ρΗ=7. (Γ8. 0的PBS缓冲 溶液中，制得抗原混合溶液，取5~10 μ?抗原混合溶液滴涂到所制备的无标记电化学发光肿 瘤标志物免疫传感器的工作电极上，在4 °C冰箱中保存晾干，ρΗ=7. (Γ8. 0的PBS缓冲溶液 清洗后，晾干，4 °C保存； 2) 以饱和甘汞电极作为参比电极、钼丝电极作为对电极，与本文档来自技高网...
【技术保护点】
无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤为：（1）金 @ 银核壳纳米棒 – 鲁米诺 – 壳聚糖复合材料（Au@AgNRs‑Lum‑Chi）的制备将20mL金纳米棒溶胶（AuNRs）和20mL 0.05~0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液混合，在30~45℃下搅拌，并顺序加入3~6 mL 0.1 mol/L的 L‑抗坏血酸（AA）溶液、0.5~1 mL 0.05 mol/L的硝酸银（AgNO3）溶液和 3~6 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液，停止搅拌，静置1~3h，离心分离，将产品重新分散到20mL 水中，得到金 @ 银核壳纳米棒溶胶（Au@AgNRs）；将3~5 mL的Au@AgNRs和 3~5 mL 1×10‑3 mol/L的鲁米诺（Lum）溶液混合，搅拌1~3h，离心分离，将产品重新分散到5mL质量分数为0.3 ~ 0.7 %的壳聚糖（CHi）溶液中，得到Au@AgNRs‑Lum‑Chi溶液；所述的AuNRs是20~40nm长的棒状金纳米粒子的水溶液；所述的Chi溶液是将Chi纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成；（2）磷酸钴铵片状材料（NH4CoPO4）的制备在40mL水中加入2.0~4.0 g铵盐和0.15~0.25 g磷酸盐，完全溶解后，加入0.15~0.25 g氯化钴，在30~45℃下搅拌10~14h，离心分离，将产品置于50℃下干燥，即得到NH4CoPO4；所述的铵盐选自下列之一：氯化铵、溴化铵、磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵；所述的磷酸盐选自下列之一：磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵；（3）无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法1）对工作电极进行预处理：将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0、3.0和0.05 µm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，依次用乙醇和超纯水进行超声清洗；2）在1）中得到的电极表面滴加5~10 µL 1~5 mg/mL的NH4CoPO4水溶液，室温下自然晾干； 3）在2）中得到的电极表面滴加5~10 µL的Au@AgNRs‑Lum‑Chi溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存；4）在3）中得到的电极表面滴加5~8 µL 10 µg/mL的肿瘤标志物抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；5）在4）中得到的电极表面滴加4~6 µL 100 µg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存，制得无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张勇，李建修，魏琴，马洪敏，杜斌，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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