高亲和力SIRP‑α试剂制造技术

技术编号:10616873 阅读:177 留言:0更新日期:2014-11-06 11:30
提供了高亲和力SIRP‑α试剂,其(i)包含相对于野生型蛋白的至少一个氨基酸变化;和(ii)具有相对于野生型蛋白增加的对CD47的亲和力。提供了组合物和方法,用于通过施用治疗剂量的包含高亲和力SIRPα试剂的药物组合物来调节哺乳动物中的吞噬作用,所述高亲和力SIRPα试剂阻断SIRPα及其配体CD47之间的生理性结合相互作用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高亲和力SIRP-α试剂政府权力本专利技术是在美国国立卫生研究院资助的合同CA086017、HL058770和CA139490下由政府支持完成的。政府具有本专利技术的一定权利。专利技术背景细胞更替开始于凋亡程序的诱发或将它们标记以去除的其他细胞变化,以及随后标志物被包括巨噬细胞、树突细胞等的吞噬细胞识别。该过程需要特异性和选择性的去除不想要的细胞。辨别健康细胞与不想要的/衰老的/濒死的细胞,不想要的/衰老的/濒死的细胞展示称为“吃我”信号、即“改变自我”的标志物或配体,其转而可以被吞噬细胞上的受体识别。健康细胞可以展示积极抑制吞噬作用的“不要吃我”信号;这些信号在濒死细胞中被下调或者以改变的构象存在。健康细胞上细胞表面蛋白CD47及其与吞噬细胞受体SIRPα的接合构成了关键的“不要吃我”信号,其可以避开多种形式介导的吞没,包括凋亡细胞清除和FcR介导的吞噬。阻断吞噬细胞上SIRPα的CD47介导的接合,或者敲除小鼠中CD47表达的缺失,可以引起活细胞和非衰老红细胞的去除。或者,阻断SIRPα识别还允许吞没正常不被吞噬的靶标。CD47是具有单Ig样结构域和5个跨膜区的广泛表达的跨膜糖蛋白,其作为SIRPα的细胞配体发挥作用,其中结合通过SIRPα的NH2末端V样结构域介导。SIRPα主要在髓样细胞上表达,髓样细胞包括巨噬细胞、粒细胞、髓样树突细胞(DC)、肥大细胞及其前体,包括造血干细胞。SIRPα上介导CD47结合的结构决定子由Lee等人(2007)J.Immunol.179:7741-7750讨论;Hatherley等人(2007)J.B.C.282:14567-75;并且SIRPα顺二聚化在CD47结合中的作用由Lee等人(2010)J.B.C.285:37953-63讨论。与CD47抑制正常的细胞吞噬的作用相一致,有证据表明:它在其迁移阶段之前和过程中在造血干细胞(HSC)和祖细胞上瞬时上调,并且这些细胞上的CD47水平决定了它们被体内吞没的可能性。CD47还在许多癌症上组成型上调。肿瘤细胞过表达CD47可以通过允许细胞逃过吞噬而增加致病性。专利技术概述提供了高亲和力SIRPα多肽及其类似物,其在本文被称为高亲和力SIRPα试剂。该试剂是天然人SIRPα蛋白的序列变体,并且具有用于阻断天然SIRPα蛋白及其受体CD47之间相互作用的体内和体外方法的效用。提供增加的亲和力的氨基酸变化定位于d1结构域,并且因此本专利技术的高亲和力SIRPα试剂包含人SIRPα的d1结构域,相对于d1结构域内的野生型序列具有至少一个氨基酸变化。这种高亲和力SIRPα试剂任选包含其他氨基酸序列,例如抗体Fc序列;野生型人SIRPα蛋白的不同于d1结构域的部分,包括但不限于天然蛋白的残基150至374或其片段,通常是在d1结构域内连续的片段;等。高亲和力SIRPα试剂可以是单体或多聚体的,即,二聚体、三聚体、四聚体等。在一个实施方案中,本专利技术提供了可溶性高亲和力SIRPα试剂,其缺少SIRPα跨膜结构域,并且包含在d1结构域内相对于野生型人SIRPα的至少一个氨基酸变化,所述氨基酸变化增加了SIRPα多肽与CD47的结合亲和力。该高亲和力SIRPα多肽可以例如通过糖基化、聚乙二醇化等而被翻译后修饰。在一些实施方案中,高亲和力SIRPα试剂是包含Fc结构域的融合蛋白。本专利技术还包括与药学可接受的赋形剂组合的高亲和力SIRPα试剂的药物制剂。这种制剂可以提供为单位剂量,例如,有效增加个体中靶向吞噬的剂量。药物制剂还包括高亲和力SIRPα试剂的冻干或其他制品,其可以复水以供使用。在一些实施方案中,提供了操纵例如巨噬细胞或其他哺乳动物吞噬细胞对细胞的靶向吞噬的方法。在这类方法中,表达CD47的细胞与有效阻断内源性SIRPα和CD47之间相互作用的剂量的本专利技术高亲和力SIRPα试剂接触。阻断该相互作用允许吞没正常不被吞噬的靶。该接触可以例如为治疗目的而在体内进行,以及例如为了筛选测定等而在体外进行。为了这些目的的高亲和力SIRPα试剂可以是多聚体的;或者是单体的。单体试剂特别用于与选择性结合被靶向吞噬的细胞的抗体组合施用。在相关实施方案中,通过使肿瘤细胞与有效阻断或掩蔽细胞表面上的CD47的剂量的高亲和力SIRPα多肽接触,允许吞没正常不被吞噬的靶,来靶向吞噬肿瘤细胞,例如实体瘤,例如癌、肉瘤、黑素瘤等;白血病;淋巴瘤等。将有效剂量的高亲和力SIRPα多肽施用给患者预防CD47和SIRPα之间的相互作用,这增加了肿瘤细胞经由吞噬的清除。为这些目的,在与被靶向吞噬的细胞结合的免疫球蛋白Fc存在下施用高亲和力SIRPα变体可能是有利的,其提供了亲吞噬信号(pro-phagocyticsignal)。在这些方面,高亲和力SIRPα多肽可以与针对一种或多种其他肿瘤细胞标志物的单克隆抗体组合,该组合物与使用单一药剂相比可以协同增强肿瘤细胞的吞噬和消除。对于该目的而言,单体高亲和力SIRPα试剂是有利的,因为它们具有低的红细胞毒性。或者,可以施用包含免疫球蛋白Fc区,例如提供亲吞噬信号的免疫球蛋白Fc区的SIRPα融合构建体。在其他实施方案中,高亲和力SIRPα试剂包含可检测标记。这种标记的试剂可用于在体外或体内的成像目的,例如肿瘤的成像。附图简述图1A-1E.高亲和力SIRPα变体的定向进化。A.CD47被可溶性高亲和力SIRPα阻断的示意图。(左)在基础状态下,癌细胞上的CD47表达激活巨噬细胞上的SIRPα,从而引发了经由SHP1和2酪氨酸磷酸酶的抑制级联并防止癌细胞吞噬。(右)可溶性的高亲和力SIRPα蛋白竞争性拮抗CD47并防止与巨噬细胞上的SIRPα接合,从而抑制吞噬。B.SIRPαV组Ig结构域(结构域1,d1)的酵母表面展示的示意图。酵母克隆(灰色细胞)给出SIRPα的不同变体(着色的拐点)。插图指示SIRPα通过与Aga2融合而连接至酵母细胞表面并用生物素化的CD47选择。C.工程化的SIRPα变体的序列和SPR亲和力测量的概要。在表头指示野生型等位基因1中突变残基的位置及其相应序列。红色文本颜色指示共有序列突变,而蓝色阴影指示共有序列中的接触残基。野生型SIRPα和结合固定化CD47的高亲和力变体FD6的代表性SPR传感器图在右侧显示。RU=响应单位。D.FD6:CD47复合物的晶体结构被描绘为含有FD6(橙色)和CD47(蓝色)的带状物的透明表面。E.野生型(深红色)和高亲和力(绿色)SIRPα:CD47复合物的叠影。插图显示SIRPαC’D环中的突变接触残基(棒状物)和CD47的结合界面(顶部,空间填充;底部,棒状物)。图2A-2H.高亲和力SIRPα变体在体外阻断CD47并刺激吞噬。A.野生型SIRPα等位基因1(WTa1,粉色)、抗CD47克隆B6H12Fab片段(橙色)或两个高亲和力SIRPα变体(FD6,CV1,绿色)对Raji淋巴瘤细胞上CD47拮抗作用的剂量-响应曲线。用与100nMAlexaFluor647-缀合的WTSIRPα四聚体竞争的滴定浓度的CD47阻断剂染色的细胞。B.使用具有媒介物对照(PBS)或与人IgG4融合的高亲和力SIRPα变体(CV1-hIgG4)的CFSE标记的Raji淋巴瘤细胞和RFP本文档来自技高网...
<a href="http://www.xjishu.com/zhuanli/05/201380010007.html" title="高亲和力SIRP‑α试剂原文来自X技术">高亲和力SIRP‑α试剂</a>

【技术保护点】
一种高亲和力SIRPα多肽,其中所述多肽缺少所述SIRPα跨膜结构域并且包含相对于野生型SIRPα序列的至少一个氨基酸修饰,并且其中所述氨基酸修饰增加了所述SIRPα多肽与CD47结合的亲和力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.01.17 US 61/587,2471.一种高亲和力SIRPα多肽,其中所述多肽缺少SIRPα跨膜结构域,包含人SIRPα的d1结构域,所述d1结构域在相对于SEQIDNO:1中包括选自下列组的一组氨基酸取代突变:·V27I;K53R;S66T;K68R;F103V;·L4V;V27L;E47V;K53R;E54Q;S66G;K68R;V92I;·L4V;V6I;A21V;V27I;I31T;E47L;K53R;H56P;S66T;K68R;F94L;·V6I;V27I;I31S;E47V;K53R;E54Q;H56P;S66G;V92I;F94L;·L4I;A21V;V27I;I31F;E47V;K53R;E54Q;H56R;S66G;F94V;F103V;·L4V;V6I;V27I;I31F;E47V;K53R;H56R;S66G;K68R;V92I;F94L;或·L4V;V6L;I31F;E47V;K53R;H56P;S66G;V92I;F103V;·V6I;V27I;I31F;E47L;K53R;E54Q;H56P;S66T;·L4V;V6I;V27I;I31F;E47V;K53R;E54Q;H56P;V63I;S66T;K68R;V92I;·V6I;V27I;I31T;E47V;K53R;E54Q;H56P;S66G;K68R;V92I;F103V;或·V6I;V27I;I31F;E47V;K5...

【专利技术属性】
技术研发人员:A·M·林K·C·加西亚K·A·魏斯可夫A·M·莱文I·L·威斯曼
申请(专利权)人:小利兰·斯坦福大学托管委员会
类型:发明
国别省市:美国;US

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