本发明专利技术属于致病疫霉线粒体基因型和异质性的鉴定技术领域。本发明专利技术的目的是提供一种基于聚合酶链式反应（PCR）的快速、准确检测致病疫霉线粒体基因型和异质性的试剂盒及检测方法。试剂盒包含PCR扩增所需要的两对专一性引物对和Mix，其中，两对引物对分别为：InDel-F：5'-GTGGGTTCGAGTCCCACTAA-3'，InDel-R：5'-CTCACCCGTTCGCTATGTTT-3'，和RSU-F：5'-ACGGAATTATCGGAAGATTT-3'，RSU-R：5'-AAATCCCTTTTATACTGTAATTTGAT-3'。检测过程如下：提取致病疫霉菌株的基因组DNA；利用两对专一性引物和试剂盒进行PCR扩增；PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；条带的观察与条带模式的命名；线粒体基因型的确定；线粒体异质性的判定。该试剂盒可用于国家动植物检验检疫部门对外来致病疫霉和农业部门对不同区域致病疫霉群体的监测，也可用于各大种薯生产企业对于基地致病疫霉特征确定和动态变化的监测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于致病疫霉线粒体基因型和异质性的鉴定
。本专利技术的目的是提供一种基于聚合酶链式反应（PCR）的快速、准确检测致病疫霉线粒体基因型和异质性的试剂盒及检测方法。试剂盒包含PCR扩增所需要的两对专一性引物对和Mix，其中，两对引物对分别为：InDel-F：5'-GTGGGTTCGAGTCCCACTAA-3'，InDel-R：5'-CTCACCCGTTCGCTATGTTT-3'，和RSU-F：5'-ACGGAATTATCGGAAGATTT-3'，RSU-R：5'-AAATCCCTTTTATACTGTAATTTGAT-3'。检测过程如下：提取致病疫霉菌株的基因组DNA；利用两对专一性引物和试剂盒进行PCR扩增；PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；条带的观察与条带模式的命名；线粒体基因型的确定；线粒体异质性的判定。该试剂盒可用于国家动植物检验检疫部门对外来致病疫霉和农业部门对不同区域致病疫霉群体的监测，也可用于各大种薯生产企业对于基地致病疫霉特征确定和动态变化的监测。【专利说明】
本专利技术属于植物病原卵菌线粒体基因型和异质性检测的
。
技术介绍
马铃薯上最具毁灭性的晚疫病由致病疫霉引起，该病曾于19世纪40年代中期在 欧洲大流行，引起国际知名的"爱尔兰大饥荒"，对该病的研究开创了植物病理学的开端。当 今，该病仍是马铃薯上第一大病害，每年全球造成经济损失为67亿美元，不包括使用农药 的费用。对于病原菌多样性的分子检测对于病害风险评估和防控具有重要意义，而线粒体 由于是母系遗传，对其基因型的测定可作为致病疫霉群体监测的可靠方法，目前国际上已 报道了 2种致病疫霉线粒体基因型的测定方法，而国际上未有致病疫霉线粒体异质性的检 测的方法。Carter在1990年首次提出了致病疫霉线粒体基因型的RFLP方法，通过分离、 纯化致病疫霉线粒体基因组DNA，再用多种限制性内切酶进行酶切电泳，发现了 4种线粒体 基因组的多态性，并将其分别命名为Ia，Ib，Ila和lib等四种线粒体基因型，也称为线粒 体单倍型。但该方法的缺点是需要分离和纯化粒体基因组DNA，操作复杂、费时，并且实验 成本很高，测定效率极低。随后，当致病疫霉lb基因型的线粒体基因组序列被公布后，1998 年Griffith等在基因组上定位了 Carter等酶切线粒体基因组的位置，在酶切位点的两侧 保守区设计了特异性引物，对该段基因进行PCR扩增，而后进行酶切，从而建立了简便、高 效的PCR-RFLP的线粒体基因组基因型的检测方法，。但由于1998年Griffith的PCR-RFLP 方法未考虑致病疫霉I型和II型本质的差别在于2kb的插入缺失，从而导致使用PCR-RFLP 方法的检测结果有时与Carter提出的RFLP方法检测结果有时不一致。此外，以上两种方法 所检测的线粒体基因组基因型的数目有限仅4种，且未能对其异质性进行检测。因此，本发 明在对4个致病疫霉线粒体基因组序列分析的基础上，发现了 2个高度变异区可用于区分 4种线粒体基因型，对2个高变区分别设计了对特异性引物对，利用聚合酶链式反应（PCR)， 专利技术了致病疫霉线粒体基因型检测试剂盒；同时，通过2个高变区扩增子条带数目可确定 其是否具异质性。该方法建立用于国家检疫部门对外来致病疫霉和农业部门对不同区域病 原菌群体的监测，也可用于各大种薯生产企业对于基地致病疫霉动态变化的监测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种兼致病疫霉线粒体基因型和异质性检测于一体的检测 试剂盒，包括2对PCR引物和Mix，以及检测方法。 1.本专利技术的技术方案如下： 从GenBank中下载已经完成测序的Carter的4种线粒体基因型（la, lb, Ila和lib) 的基因组序列。首先，用ClustalX对这4个线粒体基因组序列进行比对，用BioEdit和MEGA 软件对基因组序列进行分析，发现4个线粒体基因型基因组存在2种核苷酸多态性，一种是 由单核苷酸替代或缺失造成的单核苷酸多态性（SNP)，另外一种是在线粒体基因组的2个 高变区存在由大片段插入或缺失引起的长度多态性。在这2个高变区的两侧保守序列中， 利用NCBI中的Primer-BLAST分别设计2对专一性的PCR引物，分别为引物对InDel-F和 InDel-R，以及引物对RSU-F和RSU-R。分别利用该2对特异性引物对致病疫霉基因组DNA 进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增子的长度多态性，通过2个高变区不同扩增子 的长度多态性组合来确定致病疫霉线粒体基因型，并根据不同组合，提出一套用于确定不 同致病疫霉线粒体基因型的命名方式；同时，根据每个高变区的条带数目判断致病疫霉线 粒体是否具有异质性。 2.本专利技术设计的用于检测鉴别致病疫霉线粒体基因型和异质性的新方法是采用 以下步骤： (1) 致病疫霉基因组DNA的提取； (2) 扩增DNA片段，即进行聚合酶链式反应，用于聚合酶链式反应的2对引物的DNA序 列为： InDel-F :5'-GTGGGTTCGAGTCCCACTAA-3' InDel-R :5'-CTCACCCGTTCGCTATGTTT-3' RSU-F :5'-ACGGAATTATCGGAAGATTT-3' RSU-R :5'-AAATCCCTTTTATACTGTAATTTGAT-3' (3) 琼脂糖凝胶电泳分析； (4) 鉴定结果的判断。线粒体基因型由2对引物对扩增条带模式组合来判定，具体如 下； A. 利用InDel-F和InDel-R引物可扩增出2条长度不同的条带，其大小分别为3 kb 和1 kb，将其分别命名为L和S，不同线粒体基因型的菌株经扩增后会出现3种条带模式： L，S 和 LS ; B. 利用RSU-F和RSU-R引物对可扩增出3种长度不同条带，其长度分别为192 bp、228 bp和264 bp，分别将其命名为Vi、V2和V3，不同线粒体基因型的菌株经扩增后会出现7种条 带及其组合模式，即％，V 2，V3，VJ2，V%，V2V3， C. 综合以上2个扩增结果的组合，扩增结果有21种情况，即相应的线粒体基因型有 21 种，分别为：1^，LV2，LV3，LVJ2，LV%，LV2V 3，LVJA，SV1; SV2，SV3，SVJ2，SV%， SV2V3，SW3，LSV" LSV2，LSV3，LSVJ2，LS'%，LSV2V 3，lsw3; D. 致病疫霉线粒体异质性的基因型为：!Λν2，lvj3，lv2v 3，lvj2v3，SVJ2，SVJ3， SV2V3, SVJA, LSV" LSV2, LSV3, LSVA, LSVJs, LSV2V3 和 LSVJA 等 15 种； 本专利技术的效果是：（1)首次提出了利用PCR方法发现致病疫霉线粒体异质性的方法； (2)所建立的致病疫霉线粒体基因型检测试剂盒，大大增加了基因型的检测数目，由原来方 法所能检测到4种增加至该方法能最终确定21种线粒体基因型；（3)该试剂盒简便、高效、 准确，从而克服了前人致病疫霉线粒体基因型检测方法复杂、花费高和效率低等诸多问题。 3.【具体实施方式】为： (1) 试剂盒成分包括本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种兼致病疫霉线粒体基因型和异质性检测于一体的试剂盒，其特征在于：试剂盒包含一对特异性引物DNA序列和Mix。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨志辉，朱杰华，徐进，齐明星，秦宇轩，桂秀梅，陶晡，许小虎，张福光，杨毅清，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13
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