酶活性提高的甘露聚糖酶制造技术

本发明专利技术涉及一种酶活性提高的甘露聚糖酶，其氨基酸序列为将序列编号2第216位的酪氨酸改以色氨酸取代修饰的序列。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种酶活性提高的甘露聚糖酶，其氨基酸序列为将序列编号2第216位的酪氨酸改以色氨酸取代修饰的序列。【专利说明】酶活性提高的甘露聚糖酶
本专利技术涉及一种甘露聚糖酶，尤指一种酶活性提高的甘露聚糖酶。
技术介绍
植物细胞壁主要由纤维素（cellulose)、半纤维素（hemicellulose)及木质 素（lignin)三种物质所组成，其中以纤维素含量最多，半纤维素次之。甘露聚糖为半 纤维素中的一个重要成份，甘露聚糖主要可分成四类：直链甘露聚糖（linear mannan)、 葡萄甘露聚糖（glucomannan)、半乳甘露聚糖（galactomannan)和半乳葡萄甘露聚糖 (galactoglucomannan)。这些多糖体主要是由甘露糖（mannose)为基本单位，以β -1，4-糖 苷键（glycosidic bond)键结成骨架。内切性甘露聚糖酶（end〇-0-mannanase)为分解 自然界中大量存在的聚甘露糖的主要酶之一，这类酶能对β -1，4-糖苷键（glycosidic bond)进行随机水解作用。此甘露聚糖酶常见于许多细菌以及真菌之中。 近年来，随着自然界半纤维素资源的开发，甘露聚糖酶的工业利用价值也渐受重 视，并且被广泛地应用于不同工业上，如：造纸工业、食品及饲料工业等。在纸浆及造纸业 中，甘露聚糖酶可用来破坏半纤维素与木质素之间的键结，有利于木质素的去除，大幅降低 漂白剂及氯的用量。在食品应用上，可以当作果汁饮料的澄清剂及降低咖啡豆加工时的粘 度，减少蒸发浓缩的成本。而在动物饲料工业上可当做饲料添加剂，提高动物对饲料的转换 率。然而针对不同工业的应用，甘露聚糖酶也需有符合其不同的适用条件与范围，例如：高 耐热性、高活性及耐酸碱性等，如此在工业应用上才有其商业价值及竞争性。因此，找出符 合不同工业上所需的酶蛋白也是目前学术及产业界持续努力的目标。 为了得到更符合需求的酶蛋白，目前大致上可分为两个方向去进行：其一是从自 然界中筛选合适的酶基因，例如目前已从嗜碱菌Bacillus sp. N16-5中分离出耐碱的甘露 聚糖酶，其最适pH值为ρΗ10· 0 ;而具耐酸性的酶，则由嗜酸菌Aspergillus sulphureus分 离出来。另一个途径就是将现有已产业化的酶蛋白再加以进行基因改造，以符合不同产业 的需求。 而现今改造酶蛋白主要有两大策略：其一是随机突变（random mutagenesis)或 是将酶基因随机排列，再在特定的作用条件之下，筛选出更符合其作用条件的酶蛋白。举例 来说，有学者将Armillariella tabescens的MAN47基因采取随机突变的易错聚合酶连锁 反应（error-prone PCR)技术，将基因序列随意突变之后，送入Saccharomyces cerevisiae 系统表达。在筛选了 100多株突变株后，得到比野生株更具耐酸碱性及耐高温的甘露聚糖 酶。此策略的好处是无须深入研究酶的结构或作用机制，而是直接在特定的条件下随机去 找出更好的酶蛋白。然而，缺点即是需要大量的人力以及时间去进行大量的筛选，并且此方 法也需要有很好的大量筛选方法来配合。 另一种改造策略则是藉由研究酶的三维结构与作用机制，找出对于酶活性或特 性具有关键性的氨基酸，并针对这些特定氨基酸进行定点突变与测试，进而得到功能性 更强的改造酶蛋白。举例来说，Cartmell等人解出外切性甘露聚糖酶（exo-mannanase) CjMan26C蛋白立体结构后，发现其与内切性甘露聚糖酶CjMan26A在结构上有很高的相似 度。经由结构相互比对分析后，发现CjMan26C有四个氨基酸在空间上的位置与CjMan26A 有明显的不同，而此四个氨基酸皆位于靠近活性区的环状结构（loop)里。在经由突变了 CjMan26C这四个氨基酸后，成功的将CjMan26C活性反应模式由外切性甘露聚糖酶转变为 内切性甘露聚糖酶。由此可知，分析蛋白立体结构可提供许多有助于改造特性的信息，让研 发人员可以只针对这些特定氨基酸来进行改造，减少大量人力筛选的时间，来得到适合不 同工业产业应用的甘露聚糖酶。 因此，本专利技术欲藉由研究甘露聚糖酶的三维结构，对一些特定的氨基酸进行基因 突变，进而有效提升甘露聚糖酶在工业上应用的产业价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于改造现有甘露聚糖酶，利用结构分析及定点突变技术，有效提 升甘露聚糖酶的作用活性，藉以增加甘露聚糖酶的工业应用价值。 为达上述目的，本专利技术优选实施方式之一为提供一种甘露聚糖酶，其氨基酸序列 系为将序列编号2第216位的酪氨酸改以色氨酸取代修饰的序列。编码该序列编号2的基 因系筛选自黑曲霉（Aspergillus niger BK01)的甘露聚糖酶基因，该甘露聚糖酶系为耐热 性及耐酸性甘露聚糖酶，且其氨基酸序列系为序列编号4的氨基酸序列。又，该甘露聚糖酶 系应用于食品工业、饲料工业、以及造纸工业。 【专利附图】【附图说明】 图1显示甘露聚糖酶ManBK的基因及氨基酸序列。 图2显示甘露聚糖酶ManBK的蛋白立体结构图与瑞氏木霉菌（Trichoderma reesei)的甘露聚糖酶与甘露二糖（mannobiose)结合的复合体结构的重叠结构图。 图3显示定点突变所采用的引物序列。 图4显示甘露聚糖酶ManBK的Y216W突变型的基因及氨基酸序列。 图5显示甘露聚糖酶的活性测试结果。 图6显示甘露聚糖酶的酶动力学试验结果。 【具体实施方式】 体现本专利技术特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的 是本专利技术能够在不同的实施方式上具有各种的变化，然其皆不脱离本专利技术的范围，且其中 的说明及图式在本质上系当作说明之用，而非用以限制本专利技术。 本专利技术系从黑曲霉（Aspergillus niger BK01)筛选出甘露聚糖酶（ManBK)基因， 其所表达的甘露聚糖酶蛋白具高耐热性及耐酸性，也因此具有潜在的工业应用价值。为了 增加此耐热性甘露聚糖酶的工业应用价值，本专利技术首先利用X-ray结晶学技术，将此酶蛋 白的三维立体结构解析出来。然后将此甘露聚糖酶结构与瑞氏木霉菌的甘露聚糖酶（57% 蛋白序列相似度）与甘露二糖结合的复合体结构作重叠比对。针对其活性区或具有关键性 特性的氨基酸来做修改，以增进此酶蛋白的作用活性。以下将详述本专利技术改造甘露聚糖酶 蛋白的方法及其所得到的改良甘露聚糖酶蛋白。 首先，选择黑曲霉（Aspergillus niger BK01)的甘露聚糖酶（ManBK)基因作为 目标基因，如图1所不，ManBK基因的全长为1038个喊基（DNA序列以序列编号1标ττΟ以 及345个氨基酸（氨基酸序列以序列编号2标示）。将ManBK基因利用Xbal以及Ndel限 制酶切位构筑到pPICZaA载体中。构筑步骤当中，聚合酶连锁反应（polymerase chain reaction, PCR)所用的引物为 5' -GGTATTGAGGGTCGCGCGGCGGCGGCGGCGATGTCCTTCGCTTCCACT TCCG-3'（正向引物）及 5' -AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAGCGGAACCGATA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘露聚糖酶，其氨基酸序列是将序列编号2第216位的酪氨酸改以色氨酸取代修饰的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭瑞庭，黄建文，郑雅珊，吴姿慧，赖惠琳，林正言，黄婷沅，
申请(专利权)人：东莞泛亚太生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44